三種飼料建立大鼠缺鐵性貧血模型的比較

丁廣宇, 潘綿立, 胡 寒, 劉 藝, 沈龍海

(中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院,上海市生物物質成藥性評價專業技術服務平臺, 上海 200437)

三種飼料建立大鼠缺鐵性貧血模型的比較

丁廣宇, 潘綿立, 胡 寒, 劉 藝, 沈龍海

(中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院,上海市生物物質成藥性評價專業技術服務平臺, 上海 200437)

目的 探討三種不同飼料配方對建立Wistar大鼠缺鐵性貧血模型的影響。方法 將3～4周齡Wistar大鼠分為4組，即A、B、C和正常對照組， A、B、C組分別飼喂3種不同配方飼料,正常對照組飼喂正常飼料。實驗持續35 d, 實驗期間每周稱量各組大鼠體質量及攝食量同時觀察大鼠行為、外觀體征等變化。35 d后取血, 檢測相關血常規指標包括血紅蛋白(Hb)含量、紅細胞壓積等。結果 A組大鼠Hb含量降到90 g/L以下, 且行為和體態表現也符合缺鐵貧血特征, 達到造模要求; B組大鼠Hb含量沒有降低; C組大鼠Hb含量有所降低, 但未達到90 g/L以下。結論 A組飼料配方可以成功建立大鼠缺鐵性貧血模型，B、C組配方均不適用于缺鐵性模型的建立。

缺鐵性貧血; Wistar大鼠; 血紅蛋白(Hb)

鐵是機體內多種重要活性大分子的組成部分,尤其是紅細胞中的血紅蛋白, 當機體對鐵的攝入失衡, 將導致體內(如肝臟)的貯存鐵耗盡(iron deleption, ID),隨后紅細胞內鐵缺乏(iron deficiency, IDE), 血紅蛋白合成降低, 最終引起缺鐵性貧血(iron deficiency anemia, IDA)。IDA是鐵缺乏癥(包括ID, IDE和IDA)的最終階段，表現為細胞中含鐵酶和鐵依賴酶的活性降低，進而影響患者的精神、行為、體力、免疫功能，其發病率在發展中國家、經濟不發達地區偏高，常見于嬰幼兒和育齡婦女[1]。

目前針對這一疾病的藥理學研究, 多采用大鼠構建IDA模型。建模方法有定期放血或者飼喂低鐵飼料，這兩種方法各有優缺點: 剪尾放血成本低，但方法操作煩雜，而且建立的模型容易產生失血反應，不易成模，且非單純的缺鐵性貧血。后者雖方法簡單，但對飼料質控要求嚴，成本較高，且大鼠容易產生排斥[2]。因此開發簡單易行的造模方法，對于該疾病的研究及藥物篩選具有重要意義。

缺鐵性貧血形成的主要原因是鐵的攝入量不足、吸收障礙和丟失過多。草酸存在于很多植物中，攝入的草酸在腸胃道與可溶性鐵離子形成難溶性絡合物，從造成鐵的吸收障礙[3]，與其相似，四環素與鐵離子相互作用時也能形成復雜的難溶性復合物從而影響鐵的吸收。本試驗用A配方即缺鐵飼料和添加了草酸(B配方)和四環素(C配方)的正常飼料，考察不同飼料對于IDA造模的影響。通過比較三組飼料配方的大鼠實驗結果，旨在尋找簡易、有效的建立大鼠貧血模型方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3～4周齡清潔級雌性Wistar大鼠40只，體質量70～75 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[SCXK(滬)2012-0002]，飼養于上海醫藥工業研究院動物實驗設施[SYXK(滬)2014-0018]。

1.2 生化試劑和儀器

草酸，國藥集團化學試劑有限公司生產，批號: 20150708; 四環素，北京賽孚制藥股份有限公司，批號獸藥字(2012)010281345; 飼料顆粒機/SKJ-120，上海漢丁機械科技有限公司; 動物血液分析儀/HEMAVET 950，英國Drew Scientific公司。

1.3 飼料

飼料配方A，由江蘇美迪森生物醫藥有限公司提供[4]; 基礎粉料和顆粒料，由上海普路騰生物科技有限公司提供。

1.4 實驗方法

將40只Wistar大鼠按體質量隨機分為4組，每組10只，分別為飼喂相對應配方飼料的A、B、C組，以及飼喂正常飼料的正常對照組D。用苦味酸標記編號放入籠內，每籠5只。

配方A: 玉米淀粉(529.5 g/kg)、蛋清蛋白(200.0 g/kg)、蔗糖(100.0 g/kg)、玉米油(70.0 g/kg)、纖維素(50.0 g/kg)、混合礦物鹽(AIN-93G-MX) (35.0 g/kg)、混合維生素(AIN-93G-VX)(10.0 g/kg)、L-胱氨酸(3.0 g/kg)、氯化膽堿(2.5 g/kg)，配方來自SFDA有關大鼠缺鐵性貧血實驗方案[4]。

配方B: 標準飼料粉料, 添加草酸(850 mg/kg)。設計依據為: 草酸的大鼠LD50為7 500 mg/kg, 根據蘭州大學化工學院分析測試中心用火焰法測得一般正常清潔級大鼠飼料中鐵的含量為0.05%左右[5]，草酸和鐵離子等摩爾數絡合，根據大鼠每日攝食量約20 g換算，每只大鼠每日需要17 mg草酸，該數值低于其LD50，混合添加于粉狀飼料中，充分攪拌均勻后由顆粒飼料機制粒。

配方C: 標準飼料粉料, 添加四環素(800 mg/kg),劑量設計依據為: 四環素的大鼠LD50為800 mg/kg,成人口服劑量0.2～0.5 g/d, 6 h一次, 約每日30 mg/kg,折算成大鼠以200 mg/kg計，實驗時大鼠體質量為80 g，給藥總量為16 mg，經過換算足夠絡合飼料中的鐵離子，且低于LD50，混合入粉狀飼料中，充分攪拌均勻后由飼料顆粒劑制粒。

所有大鼠都飲用滅菌自來水, 實驗持續35 d，每日觀察大鼠毛色、活動和消化狀況，每周一測量每組大鼠體質量計算平均每只大鼠體質量，每周加入一定量飼料，通過稱量飼料剩余量，來計算該周(7 d)平均每只大鼠每日的攝食量。

同時觀察大鼠行為體態變化。35 d后取血，用全自動血清分析儀測定血清中的血紅蛋白含量(Hb)、紅細胞壓積(HCT)、 紅細胞平均血紅蛋白量(MCH)、 紅細胞平均容積(MCV)。

1.5 數據處理與統計方法

采用GraphPad Prism 6統計軟件，所有實驗數據用±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外觀體征、活動狀態、糞便形狀

A組大鼠飼喂低鐵飼料1～2周后大鼠活動減少，2～3周后，毛色粗糙失去光澤，有稀疏感，耳部和四肢皮膚相對于正常大鼠顯青色。個別大鼠見頸部毛發脫落。糞便與正常大鼠相比顯黃色，較稀，有惡臭。造模3周后體質量減輕，飲食未見減少。B組大鼠第1周對飼料排斥，好動狂躁，第2周后逐漸穩定。毛色和糞便正常。C組大鼠未見異常，活動狀態和正常對照組大鼠相似。

2.2 各組大鼠攝食量比較

實驗過程中各組大鼠攝食量呈上升趨勢，但是各組上升趨勢不同。A配方組大鼠攝食量低于正常組且在第3周后有顯著差異(P＜0.05)。B配方組大鼠攝食量從第1周開始就明顯低于正常組和C配方組(P＜0.05)。C配方組大鼠攝食量與正常組近似，與A、B兩組差異顯著(P＜0.05)(表1)。

表1 實驗大鼠平均每日飼料攝食量 g /d

2.3 各組大鼠體質量比較

各組的體質量增長趨勢不同。正常組體質量增長最快, 5周后體質量也高于其它3組。A組大鼠體質量低于正常組大鼠在第3周后有顯著差異(P＜0.05)。第4周起，B配方組大鼠體質量增長明顯低于正常組(P＜0.05)。C組體質量增長與正常組近似，與A、B組有顯著差異(P＜0.05)(表2)。

2.4 血液指標

A組大鼠Hb、HCT、MCH含量均明顯降低，其中Hb值30 d后降低到78.6 g/L左右，與正常組有顯著差異(P＜0.05)。B組Hb值以及其它指標與正常組比較近似。C組大鼠Hb為128.6 g/L,低于正常組，但高于A組(P＜0.05)(表3)。

表2 大鼠體質量變化 g

表3 各組大鼠部分血液指標 g/L

3 討論

A組大鼠在造模3周后出現貧血癥狀，主要表現為體型瘦小，被毛粗糙，失去光澤，有稀疏感，耳部和四肢皮膚相對于正常大鼠顯青色。部分大鼠脖頸部皮毛出現脫落現象, 這可能是貧血造成的皮膚潰瘍。A配方組大鼠Hb值降低到78.6 g/L左右，相對于正常組有顯著性差異, 且低于90 g/L, 大鼠表現的行為體態特征也有助于判斷為IDA，兩個特征均與原文獻報道[3,6]相符即A組造模成功，提示A配方低鐵飼料能夠快速建立大鼠缺鐵性貧血模型; B配方組大鼠Hb值為169.6 g/L，與正常組的172. 3 g/L差異不顯著，表明草酸并不能實質性減少鐵吸收，影響血紅蛋白的含量。可能原因是草酸雖然降低二價鐵的吸收，但是會同時促進三價鐵的吸收，因此并不會影響鐵元素的攝入量, 導致造模失敗[7]。C組大鼠與正常組大鼠比較，各項活動體征相似, 在實驗結束后大鼠平均Hb值為128 g/L，較正常組有所降低，但未降低到100 g/L以下，達不到造模的要求。這可能是因為添加四環素的劑量不足，有待進一步研究。缺鐵時，紅細胞合成血紅蛋白量減少，致使紅細胞體積變小，所以營養性貧血大鼠的Hb減少，同時HCT值也降低，紅細胞數量并沒有變化。而A配方組大鼠Hb和HCT遠低于正常對照組(P＜0.05), 符合缺鐵性貧血特征。此外, 有文獻報道[8], 在進行貧血大鼠造模時, 應該飼喂去離子水, 以防止外界鐵離子干擾。本實驗造模過程中使用的是滅菌后的自來水，對造模結果影響不明顯，這是因為低鐵飼料中的鐵離子含量大約8.01 mg/kg, 而自來水中的鐵離子含量為0.3 mg/L,低鐵飼料中的鐵含量遠遠大于自來水中鐵離子含量，實驗結果證明滅菌后的自來水對于單純造模沒有影響。

綜上所述，經典的缺鐵性貧血模型造模方法不論是在造模時間，還是造模效果上都表現非常出色，但是由于對它的飼料配方有嚴格要求，所以模型不易制備，此外單一的造模方法對于一種疾病而言并不具有說服力，因此，在此基礎上進行了不同飼料配方的研究，盡管結果不甚滿意，但是獲得了一些經驗教訓，為下一步建立新的貧血模型打下了一定基礎。

[1] Xiao C, Lei X, Wang Q, et al. Effects of a tripeptide iron on iron-deficiency anemia in rats[J]. Biol Trace Elem Res, 2016, 169(2):211-217.

[2] 劉戍年. 大鼠缺鐵性貧血模型的建立[J]. 中國病理生理雜志, 1995, 11(4):361-362.

[3] 張琪, 徐達道. 膳食中鐵吸收及其影響因素[J]. 國外醫學:衛生學分冊, 1986, 13(3):149-151.

[4] 國食藥監保化[2012]107號. SFDA改善缺鐵性貧血功能評價方法[S], 2012.

[5] 葛可佑. 中國營養科學全書[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2004:665- 668.

[6] 田婷, 馮楠. Wistar大鼠缺鐵性貧血模型的建立[J]. 當代醫學, 2011, 17(35):41-42.

[7] Genannt Bonsmann SS, Walczyk T, Renggli S, et al. Oxalic acid does not influence nonhaem iron absorption in humans: a comparison of kale and spinach meals[J]. Eur J Clin Nutr, 2008, 62(4):336-341.

[8] 呼延武, 馬雅靜, 秦楠, 等. 雌性大鼠缺鐵性貧血模型的建立及相關指標觀察研究[J]. 中國婦幼保健, 2015, 30(1): 128-130.

Comparative Study on Iron Deficiency Anemia Rats Model by Three Different Formula Feeds

DING Guang-yu, PAN Mian-li, HU Han, LIU Yi, SHEN Long-hai
(China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai Professional and Technical Service Center for Biological Material Druggability Evaluation, Shanghai 200437, China)

Objective To explore the effect on iron deficiency anemia rat model induced by 3 different formula feeds.MethodWistar rats at age of 3～4 weeks were randomly divided into 4 groups: group A, group B, group C and control group. The groups A, B, C were fed with 3 different formula feeds respectively, and control group was fed with normal feed. Experiment lasts for 35 days, the body weight and food intake of rats in each group were measured every week. Meanwhile, behavior and appearance sign was noted during the experiment. Rat’s blood was collected and tested after 35 days, including hemoglobin, hematocrit, etc. ResultsHemoglobin(Hb) concentration of group A decreased to 90 g/L and morphological features met the requirments. Hb in group B did not decrease; Hb in group C decreased a little but no less than 90 g/L. ConclusionThe formular A feed can establish iron deficiency anemia model successfully, formula B and C are not applicable for the model building.

Iron deficiency anemia; Wistar rats; Hemoglobin(Hb)

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0433-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.006

2016-08-02

丁廣宇(1992-), 男, 碩士研究生, 研究方向: 方向為免疫藥理學。E-mail: 1293032013@qq.com

沈龍海(1963-), 男, 碩士生導師, 研究方向: 免疫藥理學與腫瘤藥理。E-mail: shenlh28@163.com