聚合酶鏈反應檢測麻風分枝桿菌的研究進展

劉 敏 郝明巨

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聚合酶鏈反應檢測麻風分枝桿菌的研究進展

劉 敏1郝明巨2

麻風的早期診治對減少疾病傳播、預防疾病進展和致殘起重要作用。本文對PCR技術在檢測麻風桿菌中的應用作一綜述。

麻風； 麻風分枝桿菌； 聚合酶鏈反應

麻風桿菌在體外尚不能培養，常用的檢測麻風菌的實驗室方法是皮膚組織液刮片抗酸染色法(AFB)。AFB染色的方法敏感度很低，需要每克組織中至少含有104個細菌才能在顯微鏡下觀察到[1]。PCR是一種高度敏感和特異的檢測樣本細菌DNA的方法，在過去30年里，已開發了多種用于麻風桿菌DNA的PCR檢測方法，這些方法的應用對麻風的早期診治和預防有重要意義。

1 PCR技術檢測麻風分枝桿菌的實驗室方法學研究進展

1.1 方法學進展 1989年，Hartskeerl等通過基因提取、擴增、識別等過程，檢測麻風36kDa抗原編碼基因，發現具有很高的靈敏度和特異性[2]。1990年，Williams等[3]基于探針雜交技術建立了一套檢測感染樣本中麻風菌DNA的PCR方法。同年，Plikaytis等運用巢式PCR的方法，采用兩步法擴增麻風菌DNA片段，將靈敏度提高到了單個菌體的水平，縮短了檢測時間[4]。單管PCR方法的運用避免了二次擴增的污染，簡化了操作流程，而且提高了實驗的靈敏度。2001年，Cole等[5]首先完成了麻風菌的全基因組測序，之后麻風菌的PCR檢測得到了迅猛發展。實時定量PCR技術的應用，明顯提高了檢測的敏感度和特異性，大大縮短了檢測時間，而且能夠對細菌DNA進行直接定量，評估病人體內的細菌指數[6，7]。

1.2 檢測的DNA目標片段 能夠作為麻風菌DNA序列PCR擴增的靶基因有很多，包括18kDa、36kDa、65kDa等蛋白編碼基因[4，8]、85抗原復合體(Ag85)基因[6]、sodA和16SrRNA[7]、多拷貝重復序列(RLEP)[9]、TTC重復序列[10]、HSP18 mRNA等[11]。由于重復序列存在于基因組DNA的多個部位，因此選擇重復序列作為PCR的靶向DNA能夠提高靈敏度，RLEP能夠檢測出10 fg含量的麻風菌DNA[12]。Martinez等運用定量PCR的方法比較了sodA、16SrRNA、RLEP和Ag85B對麻風的診斷價值，發現幾種序列的特異性沒有顯著性差異，Ag85B、16SrRNA、sodA敏感度分別為66.1%、62.9%、59.7%，而RLEP敏感度最高為87.1%[13]。

Turankar等[14]對麻風病人的皮膚組織液切刮涂片、血液和病人周圍環境中的土壤標本運用PCR的方法進行檢測，比較了RLEP、rpoT、SodA和16SrRNA基因的敏感度的差異，同樣發現RLEP基因的敏感度是最高的，分別能夠檢測出83%的皮膚切刮涂片標本、36%的土壤樣本和所有血液陽性的標本，而且，在細菌指數BI陰性的麻風病人血液樣本中仍有53%的陽性率。需要注意的是，RLEP基因高度保守，在其它分枝桿菌屬也存在許多的同源序列，容易使實驗結果出現假陽性[15]。最近的一項研究以麻風菌的4α萄聚糖轉移酶基因(ML1545)作為靶點，與RLEP相比，具有非常高的靈敏度和特異性[16]。

1.3 檢測樣本類型 PCR不僅可以檢測皮膚活檢標本，還可以用于檢測皮膚組織液切刮涂片、尿液、口腔和鼻腔拭子、毛囊、鼻腔分泌物、淋巴和血液等樣本的檢測[11，17-21]。皮膚活檢樣本可以預先經過石蠟包埋、福爾馬林固定等處理后進行PCR檢測，也可以將樣本貯存于70%乙醇和FTA?洗脫卡中，甚至經過抗酸染色的推片也能夠用于麻風的分子診斷[22-24]。這些標本非常利于樣本的貯存和轉運，便于樣本的回顧性分析和轉運至參考實驗室進行診斷的確認。非侵入性標本在臨床上易于獲得，方便取材，對患者的創傷小，給麻風菌的檢測帶來便利，應用前景廣闊，但目前來看，皮膚活檢仍是一種應用最廣泛和陽性檢出率最高的樣本。

近幾年，有學者[14，25]在麻風高流行區開展麻風分子流行病學研究中，對麻風菌污染的土壤和水源進行了檢測，檢測到了麻風菌的DNA，為麻風流行病學傳播提供了依據。

2 PCR技術檢測麻風的臨床應用

2.1 用于少菌型麻風的診斷 少菌型麻風由于皮損中麻風菌含量較少，臨床上診斷較為困難。Martinez等通過PCR方法在79.2%的常規麻風菌檢查為陰性的患者皮損中檢測出麻風桿菌[6]，RLEP能夠檢測出73%的麻風菌指數(BI)為0的麻風病患者皮損內的麻風菌[13]。國內研究者運用RT-PCR的方法檢測51例PB病人，38例呈陽性，敏感度達到了8 fg。一項回顧性研究中，檢測了一組既往診斷為皮膚病的麻風菌的不同基因(Ag85B、sodA、16S rRNA和RLEP)[7]，當包含大量少菌樣本(單一皮損和結核樣型麻風)時，雖然敏感度有所下降，但仍有50%。由此可見，PCR反應的高靈敏度和特異性非常有助于早期麻風或少菌型麻風的診斷。

2.2 用于單純神經炎性麻風(PNL)的診斷 PNL表現為皮膚麻痹或感覺喪失，皮損區域內神經腫大，但無肉眼可見的皮損。病人往往鏡檢和組織學檢查陰性，沒有典型的皮膚損害，很容易被漏診。Bezerra等研究者通過PCR的方法發現，約1/3神經活檢抗酸染色檢查陰性的PNL病人，能夠檢測到麻風菌[26]。Jardim等證實，PCR對于PNL病例的診斷優于抗PGL-I抗體和抗酸染色鏡檢[27]，因此，PCR為PNL提供了一種高靈敏度的診斷方法。

2.3 用于麻風的治療監測 PCR不僅用于麻風的診斷，而且能夠評估病菌載量，有助于疾病的治療監測。Santos等[21]利用RLEP法PCR檢測了麻風病人的毛發球囊，血清、鼻腔分泌物、淋巴和皮膚活檢樣本，發現在MDT治療長達8年以后，以上臨床樣本中，至少有一項PCR檢測為陽性的病人所占的比例仍有54.5%。因此，這種基于DNA的PCR分析容易引起“臨床假陽性”，不能真實的反應治療效果。鑒于此，一些研究通過逆轉錄PCR技術來評估麻風菌載量。基于對代表活菌標志的16S rRNA的基因表達分析，溫艷等[28]運用RT-PCR方法擴增14例麻風患者治療前、中、后皮損組織麻風菌16S rRNA，發現麻風活菌量隨治療時間的延長也隨之下降。然而，Phetsuksiri等[29]發現在MDT治療6個月后，雖然PB病人的陽性率下降為4%，仍有44%的多菌型(MB)病人能夠檢測到16S rRNA。

由于16S rRNA相對穩定，同時也是一種管家基因，缺乏靶基因來對模板進行標準化以用于麻風菌定量檢測，為解決上述問題，Martinez等[7]提出一項基于RNA/DNA比值的實時定量PCR技術，利用麻風菌特異性RNA相對于總DNA的降低以評估治療效果。體外實驗表明，在利福平作用后的48小時就有比值的降低，病人活檢樣本證實了MDT治療與基因表達水平的相關性，這種方法可以對麻風病人治療和耐藥監測進行隨訪[30]。Lini等[11]分別檢測麻風菌DNA和HSP 18mRNA來觀察麻風療效，他們檢測了47例麻風患者中石蠟包埋樣本中麻風菌DNA和mRNA拷貝數，在經歷了2年的MDT治療后，雖然仍能在皮損部位檢測到麻風菌DNA，但已經檢測不到HSP18mRNA。由此可見，基于RNA的PCR檢測也有助于評價麻風治療效果。

2.4 用于麻風菌耐藥基因的檢測 麻風菌耐藥對麻風化學治療帶來嚴峻挑戰，對利福平耐藥菌株是由編碼細菌RNA聚合酶β亞單位的rpoB基因發生突變所致。2001年，Honoré等[31]通過PCR擴增和一系列寡核苷酸探針進行雜交，檢測出對利福平(RFP)耐藥麻風菌株。王紅斌等利用Q-solution作為PCR反應增效劑，巢式PCR提高PCR敏感性，快速、高效地擴增出RFP耐藥的rpoB基因片段，再通過測序檢測出麻風菌對RFP的耐藥基因[32]。除了能夠檢測出對利福平耐藥的rpoB基因突變，有研究者利用PCR擴增后對基因產物進行測序或者一種新的“實時定量PCR-高分辨熔解分析(RT-PCR-HRM)”技術，能夠檢測出對氨苯砜和氧氟沙星等喹諾酮類藥物耐藥分別相關的folP1、gyrA基因突變[33,34]。因此，PCR對于檢測麻風桿菌耐藥基因，進而選擇合適的抗菌藥物，對病人進行個體化治療發揮不可替代的作用。

2.5 用于麻風密切接觸者的發病監測 對家庭密切接觸者的監測和隨訪是防控麻風的重要環節，通過PCR技術能夠早期發現麻風菌的感染。麻風菌主要通過飛沫傳播，因此許多研究以鼻腔拭子作為樣本，通過PCR方法檢測家庭接觸者的麻風菌DNA。值得注意的是，大約1%～10%的家庭密切接觸者鼻腔拭子中能檢測出麻風菌DNA，但是并不代表這些陽性個體最終會發病[35]，如此高的陽性率對PCR監測密切人群帶來疑問。有研究顯示PGL-I試驗陽性的密切接觸者發病的風險較大[36]，因此有研究者建議將PCR與PGL-I聯合測定用于識別家庭密切者的亞臨床感染，提前用藥進行預防[37]。PCR對于監測麻風密切接觸者的意義值得進一步研究。

2.6 用于麻風流行病學傳播的研究 環境因素對于麻風菌的傳播得到越來越多的重視。利用PCR檢測麻風菌污染的土壤和水源有助于分析傳染源，為麻風流行病學傳播提供依據。Lavania等采用PCR擴增麻風菌16S rRNA發現，在麻風流行區土壤中有55%的樣本呈陽性，而在非麻風流行區僅有15%陽性率。Turankar等[25]利用PCR擴增土壤中麻風菌特異性RLEP(129 bp)，并運用單核苷酸多態性(SNP)和DNA測序分析其亞型，結果表明，52份土壤樣本有17例呈陽性，亞型分析表明土壤中的麻風菌與病人和密切接觸者均來自于同一感染源。邢燕等運用巢式PCR擴增麻風菌特異性RLEP并對產物進行測序的方法，檢測了70份麻風流行區的水和土壤樣本，有36份PCR呈陽性，經測序確認有21份含麻風桿菌，確認率達58%。由此可見，麻風病流行村莊的水、土壤中的麻風桿菌可能是麻風病的傳染源。環境中麻風菌的存在對于麻風流行病學中的意義有待進一步研究。

3 結語

PCR的特異性好，敏感度高，操作簡便、快速，尤其是實時定量PCR技術的應用，大大縮短了檢測時間，而且能夠對細菌DNA或RNA進行直接定量，評估病人體內的麻風菌指數進行臨床分型。RNA水平的定量對于監測麻風療效有著良好的效果。PCR與PGL-I聯合聯合測定有助于識別家庭密切者的亞臨床感染。但應注意的是，目前報道中對麻風桿菌檢測的目的基因或片段多不一致，檢測方法也多種多樣，各實驗室報道的敏感度、特異性變異均較大，對各個實驗室麻風菌DNA檢測的評價體系有待完善。而且，PCR對技術要求較高，需較復雜的實驗設備及技術支持。不同核酸提取方法、污染物的控制等實驗條件，以及實驗室工作人員水平都會對檢測結果帶來影響。臨床實驗室必須充分了解 PCR測定的不確定性，并且采取相應質控措施，才能確保試驗結果的準確性。

同時我們也應該看到，PCR方法檢測麻風桿菌雖然敏感，但對麻風的診斷仍有局限性，主要原因在于麻風作為一個慢性傳染病，亞臨床感染以及臨床帶菌現象比較常見，即使常規組織液查菌檢查到抗酸桿菌，在沒有臨床表現時，也無法診斷麻風。總之，PCR對于麻風疑難病例如早期PB和PNL的診斷、化學藥物治療評估、耐藥性監測和密切接觸者的監測等提供了新的技術，隨著多種PCR技術的開發和更多敏感、特異的基因用于麻風檢測，PCR檢測麻風桿菌的方法將會得到越來越廣泛的應用。

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(收稿：2016-04-20 修回：2016-11-19)

Update of polymerase chain reaction in the detection of mycobacterium leprae

LIUMin1,HAOMingju2.

1.DepartmentofClinicalLaboratory,JinanDermatosisPreventionandControlHospital,Jinan250001,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,QianfoMountainHospitalofShandongUniversity,Jinan250014,China.

HAOMingju,E-mail:haomingju@163.com

Earlier diagnosis and treatment of leprosy is of great importance in reducing spread of leprosy and preventing progression of disease and disability. This article summarizes the use of PCR techniques to detect Mycobacterium leprae.

leprosy; Mycobacterium leprae; polymerase chain reaction

1濟南市皮膚病防治院檢驗科，濟南，250001 2山東省千佛山醫院檢驗科，濟南，250014

郝明巨，E-mail: haomingju@163.com