阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質疏松癥的實驗研究進展

蘇菲 桑宏勛

第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科，陜西 西安 710032

骨質疏松癥是一種全身性、代謝性骨骼系統(tǒng)疾病，其病理特征為骨量降低、骨微細結構破壞、骨脆性增加，骨強度下降，易發(fā)生骨折；與年齡、性別、種族等因素密切相關，絕經(jīng)后婦女多發(fā)[1]。絕經(jīng)后骨質疏松(POP)是由于婦女絕經(jīng)后，卵巢功能衰退，體內雌激素水平隨之下降，雌激素的骨骼效應消除后，破骨細胞的骨吸收大于成骨細胞的骨形成作用導致的骨質疏松[2]。尤其絕經(jīng)后婦女的骨質疏松癥和骨折并發(fā)癥發(fā)病率更高，男女比率約1∶8[3]。目前，骨質疏松性骨折的治療包括外科干預、積極應用藥物治療及功能鍛煉等。治療骨質疏松藥物種類很多，但存在著許多的問題，如副作用較大，費用較高等。

阿司匹林(Aspirin)是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，早在公元前5世紀，古希臘醫(yī)生希波克拉底已從柳樹皮提取的苦味粉末用來鎮(zhèn)痛、退燒。傳統(tǒng)臨床應用中， 解熱鎮(zhèn)痛、消炎抗風濕是其常用的范疇，后來又發(fā)現(xiàn)其有抗凝血、消炎等作用，從而應用于心腦血管疾病中，降低心腦血管疾病的發(fā)生率及死亡率[4-7]。這一百年老藥的新用途仍在不斷地被發(fā)現(xiàn)和應用。阿司匹林臨床上還可用來治療糖尿病[8]、抗腫瘤[9]、防治老年性白內障、治療膽道蛔蟲病、提高妊娠成功率、降低流產(chǎn)發(fā)生。此外阿司匹林在農(nóng)業(yè)上有抗旱能力，提高種子發(fā)芽率，預防農(nóng)作物病害，減少作物落花落果，改善農(nóng)作物品質，提高農(nóng)作物產(chǎn)量等作用。

近年來，流行病學研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可提高老年人的骨密度[10,11]，從而推斷其可治療絕經(jīng)后骨質疏松癥。阿司匹林有多種生物學途徑，如有抑制COX1、COX2和PG2活動等，目前還沒能完全闡明阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質疏松詳細的功能機 制，有以下多種可能與治療骨質疏松相關的生物學途徑：①抑制Fas抗體誘導骨髓間質干細胞的死亡，誘導活化的T細胞的死亡；②抑制去勢小鼠成纖維細胞集落單位的生成和誘導骨髓間質干細胞的增殖；③增加Runx2基因的表達，從而提高骨髓間質干細胞端粒酶活性和長度；④降低酸性磷酸酶活性；⑤減少RANKL表達，增加OPG的水平；⑥加速退化磷酸β-蛋白的降解，增加Wnt信號的水平[12]。在此方面，實驗研究取得了一定進展。阿司匹林是一種老藥，不但副作用較少、廉價，而且治療疾病的范圍廣。因此探討阿司匹林對骨質疏松的作用及其機制意義重大，筆者將對阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質疏松的實驗研究進展做一綜述。

1 POP動物模型的構建

目前構建POP的動物模型多使用Sprague-Dawley(SD)或者Wistar雌性大鼠，在適當?shù)膶嶒灄l件下適應一段時間，通過摘除雙側卵巢模擬女性絕經(jīng)，摘除卵巢后的雌性大鼠，因雌激素下降，形成以松質骨丟失為主的高轉換型骨質疏松癥，這一特點與臨床絕經(jīng)后骨質疏松的病理機制相似[13-15]。

2 阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質疏松的實驗研究

2.1 在體實驗

在體實驗研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對骨質疏松大鼠的骨密度、骨組織形態(tài)學及骨生物力學、骨代謝指標等均有調節(jié)作用。

2.1.1提高骨密度：Yamaza等[12]用低劑量阿司匹林研究其對去勢鼠的骨密度影響。對3月齡的去勢鼠進行為期3個月低劑量阿司匹林治療，然后使用顯微CT分析發(fā)現(xiàn)，阿司匹林治療組顯著改善去勢小鼠骨小梁和皮質骨密度。Chen等[16]通過動物實驗探討阿司匹林對絕經(jīng)后骨質疏松癥的治療作用。將40只3月齡SD雌性大鼠隨機分成5組:對照組(Sham)、去勢組(OVX)及3個阿司匹林治療組(Aspirin)。OVX及Aspirin組采用卵巢切除法去勢,飼養(yǎng)3個月建立骨質疏松模型。3個阿司匹林治療組分別為8.93、26.79及80.36 mg/kg(A1、A2及A3),每天灌胃1次，連續(xù)灌胃3個月，Sham組和 OVX 組每天用等量的生理鹽水灌胃3個月。雙能X線吸收骨密度測量儀(DXA)及Micro-CT測量結果顯示：3個阿司匹林治療組腰4椎體骨密度、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量均顯著高于OVX組，且與Sham組相近。表明阿司匹林可以有效地促進大鼠絕經(jīng)后骨質疏松骨小梁的改建,改善骨小梁的三維結構，增加骨質的骨密度。Huang 等[17]通過去勢大鼠骨質疏松性骨折愈合模型，探討阿司匹林對絕經(jīng)后骨質疏松的影響。將60只3月齡雌性Wistar大鼠，隨機分成去勢組50只，假手術組5只和空白組5只，構建去勢大鼠骨質疏松模型。確認模型成功后，將去勢組大鼠全部造成左側股骨中點骨折，用克氏針髓內固定。再將制成骨折模型的50只大鼠，隨機分成A組和B組(每組25只)，A組給予阿司匹林灌胃，33 mg/次，1次/d，B組給予等量生理鹽水。兩組分別于骨折術后測定骨密度值，然后處死取骨痂，行骨痂組織學檢查，8、12 w行放射學觀察。兩組剩余的5只大鼠于12 w時行左股骨生物力學測定。結果顯示阿司匹林組各時間點骨密度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。

2.1.2改善骨組織形態(tài)學及骨生物力學：Chen等[16]通過動物實驗也證實阿司匹林可以有效地促進大鼠絕經(jīng)后骨質疏松骨小梁的改建，改善骨小梁的三維結構，增加骨質的骨密度和力學強度。Huang等[17]實驗結果顯示，組織學觀察到HE染色,阿司匹林組軟骨內成骨過程較對照組加快；生物力學測定顯示，術后12 w，阿司匹林組左側股骨的三點彎曲載荷高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。從而證明阿司匹林能夠促進去勢大鼠骨質疏松性骨折愈合，增加骨質的骨密度和生物力學強度。Yao等[18]觀察阿司匹林對于趨勢大鼠骨質疏松的影響，探究不同劑量及不同時期口服阿司匹林對骨質疏松的輔助治療作用。取42只6個月齡的雌性Wistar大鼠，隨機選取6只作為假手術組(A)，余36只作為去勢組。去勢組分為阿司匹林預防組：去勢對照組(B)，去勢阿司匹林(8.92 mg/kg)組(C)，去勢阿司匹林(26.75 mg/kg)組(D)和阿司匹林治療組：去勢對照(E)，阿司匹林(8.92 mg/kg)組(F)，阿司匹林組(26.75 mg/kg)組(G)。預防組于去勢后3 d給予不同劑量阿司匹林灌胃，治療組于去勢后12 w灌胃。對42只大鼠雙側股骨干進行取材，對雙側股骨干行生物力學測定。結果顯示預防部分與治療部分的去勢對照組較假手術組、去勢8.92 mg/kg組及去勢26.75 mg/kg的三點彎曲載荷顯著降低(P<0.05)。預防組與治療組同劑量間比較，預防組的最大破壞應力指標高于治療組(P<0.05)。表明早期應用阿司匹林能增加去勢大鼠的骨密度,增加骨質生物力學強度。Wang等[19]研究阿司匹林對去勢大鼠腰椎微觀結構的影響。取48只3月齡SD雌性大鼠隨機分為6組：去勢組(OVX組)、對照組(Sham組)及4個阿司匹林治療組(Aspirin組)，每組8只。OVX組及Aspirin組采用卵巢切除法建立骨質疏松模型。去勢后1w，阿司匹林治療組劑量分別為2.25、4.46、8.92及26.75 mg/kg(A1、A2、A3及A4組)，每天灌胃1次，OVX組及Sham組予同等量生理鹽水灌胃。灌胃3個月后處死取腰椎椎體，以Micro-CT進行測量分析。Micro-CT分析表明：與OVX組比較,阿司匹林各劑量組骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨密度(BMD)均顯著性提高(P<0.01)，骨表面積骨體積比(BS/BV)、骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著性降低(P<0.01)，阿司匹林各劑量組BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD與Sham組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。表明阿司匹林可以改善去勢大鼠骨小梁結構，增加骨質密度，對去勢大鼠骨質疏松具有防治作用。

2.1.3改善骨代謝生化指標：Wang等[20]研究阿司匹林預防去勢大鼠骨質疏松的作用及機制。實驗動物分組及干預同文獻[10]，去勢大鼠灌胃3個月后觀察血清骨源性堿性磷酸酶及骨鈣素水平。結果顯示與OVX組比較，8.92及26.75 mg /kg劑量阿司匹林組骨源性堿性磷酸酶顯著降低(P<0.05)。4.46、8.92及26.75 mg /kg劑量阿司匹林組骨鈣素與Sham組相比顯著升高(P<0.05)。提示阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質疏松的發(fā)生機制可能是通過抑制骨吸收及刺激骨形成發(fā)揮作用。

2.1.4調節(jié)相關細胞因子表達：Yang等[21]探討阿司匹林對去卵巢骨質疏松模型鼠體內白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)表達的影響，以及其防治骨質疏松的作用。選取Sprague-Dawley大鼠60只,隨機分為對照組(10只)和去卵巢模型組(50只)，術后1 w去卵巢模型組大鼠再隨機分為骨質疏松組，其中,A組(0.25 mmol/L阿司匹林)、B組(0.5 mmol/L)、C組(1.0 mmol/L)和D組(1.5 mmol/L),各10只。檢測各組血清和骨組織IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平，同時采用Micro-CT對骨小梁微觀三維形態(tài)結構進行分析。結果骨質疏松組血清IL-1、IL-6、TNF-α、M-CSF分別為80.15±7.18、82.16±6.63、30.21±4.73 pg/mL和11.42±4.25 pg/mL，均明顯高于對照組(P<0.05)。A、 B、 C、D組中，D組IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平最低(P<0.05)。骨質疏松組骨組織IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF分別為71.24±8.10、78.02±5.15、26.92±3.23pg/mL和(10.22±3.15)pg/mL，均明顯高于對照組(P<0.05)；A、B、C、D組中，D組IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平最低(P<0.05)。提示阿司匹林能抑制去勢大鼠骨流失，這可能與阿司匹林抑制大鼠血清和骨組織IL-1、IL-6,、TNF-α和M-CSF的表達有關，從而使破骨活動減弱的作用。

2.2 離體實驗

2.2.1促進成骨細胞表達：Feng等[22]通過體外試驗研究阿司匹林對骨髓基質細胞成骨性分化的影響。培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質細胞(BMSCs)，傳代3次后進行成骨誘導分化，誘導培養(yǎng)基中加入不同濃度阿司匹林(0.5、1、2、5、10 mmol/L)，同時設立對照組。采用cck-8法分析細胞增殖情況。比較阿司匹林組與對照組在細胞堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素(OC)分泌量、鈣結節(jié)染色等方面的成骨性差異。結果顯示阿司匹林無促進細胞增殖活性，而高濃度阿司匹林能夠強烈抑制細胞增殖。0.5、1、2 mmol/L濃度阿司匹林可促進BMSCs的成骨性分化，中低濃度組堿性磷酸酶含量、骨鈣素分泌量在不同階段顯著高于對照組。14d茜素紅染色可見中低濃度組鈣結節(jié)數(shù)量高于對照組。提示中低濃度阿司匹林作用于骨髓基質細胞可促進其成骨細胞特性表達,表明阿司匹林有促進骨代謝合成的作用。

2.2.2抑制破骨細胞分化成熟：Zhang等[23]研究不同濃度阿司匹林對體外培養(yǎng)大鼠破骨細胞(Osteoclast, OC)分化成熟及骨吸收活性的影響。建立由核激活因子受體配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophagecolony stimulating factor, M-CSF)共同作用的大鼠破骨細胞骨髓誘導體系，將雌激素(10～6 mmol/L)和不同濃度的阿司匹林(0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)分別作用于破骨細胞。誘導培養(yǎng)后分別對破骨細胞進行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色，觀察細胞形態(tài)并計數(shù)破骨樣細胞數(shù)量；將各組破骨細胞接種于骨磨片上，建立破骨細胞-骨磨片活性分析模型，于不同時間點對骨磨片進行光鏡和掃描電鏡觀察，分析計算骨吸收陷窩面積。結果顯示隨著阿司匹林濃度的增加，阿司匹林組TRAP陽性多核破骨細胞數(shù)量、骨吸收陷窩面積逐漸減少直至消失。與雌激素組相比，低濃度阿司匹林組(0.25 mmol/L)沒有明顯差異；但中、高濃度阿司匹林實驗組(0.5、1.0、1.5 mmol/L)破骨細胞數(shù)量和骨吸收陷窩面積減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明阿司匹林可抑制破骨細胞的分化成熟及骨吸收功能，且呈劑量依賴性。

2.2.3抑制破骨細胞RANK表達：Zhang等[24]體外試驗研究不同濃度阿司匹林對體外培養(yǎng)大鼠破骨細胞(osteoclast, OC)RANK(receptor activator of nuclear factor-κB,核因子κB受體活化因子)表達的影響。采用RANKL和M-CSF誘導大鼠骨髓單核巨噬細胞破骨分化模型,給予不同濃度的阿司匹林(0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)和雌激素(雌二醇10～6 mmol/L)處理，而后進行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色觀察細胞形態(tài)特征，掃描電鏡觀察骨磨片破骨細胞骨吸收陷窩，RT-PCR技術檢測破骨細胞表面RANK基因的表達，ELISA法檢測RANK蛋白的表達。結果示阿司匹林和雌激素都可以使大鼠破骨細胞成熟分化程度和骨吸收活性降低，抑制破骨細胞RANK基因和蛋白的表達，且阿司匹林的抑制作用具有劑量依賴性。表明阿司匹林對大鼠破骨細胞RANK的表達有抑制作用且呈劑量依賴性，從而抑制破骨細胞的成熟分化及骨吸收功能。

2.2.4抑制破骨細胞相關信號通道：Zeng等[25]通過離體實驗探討阿司匹林對破骨細胞生成的影響及其分子機制。體外培養(yǎng)RAW264.7細胞,以100 ng/mL核激活因子κB(NF-κB)受體配體(RANKL)誘導培養(yǎng)，并同時添加不同溶度的阿司匹林(0、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)培養(yǎng)5d。在不同時間點,通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色的方法來觀察破骨細胞誘導生成能力，用實時熒光PCR方法檢測其破骨細胞系標志基因，包括組織蛋白酶K(CTSK)、TRAP、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和降鈣素受體(CTR)mRNA的表達。裂解不同培養(yǎng)條件的細胞并提取蛋白上樣，行Western印跡檢測NF-κB通道蛋白的表達以及有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPKS)通道蛋白的表達，通過免疫熒光的方法分析確定NF-κB的P65的核易位。結果顯示阿司匹林抑制RANKL誘導的破骨細胞生成,隨著阿司匹林濃度增加，破骨細胞形成數(shù)量明顯減少；其標志性基因TRAP、CTSK、MMP9及CTR的mRNA表達均有所下調；磷酸化的P65、P50、IKB-a、P38以及氨基端激酶(C-JNK)和胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)蛋白表達均有所減少，而其非磷酸化的蛋白表達水平無明顯變化。阿司匹林同時對NF-KB P65的核易位也表現(xiàn)出抑制效果。表明在RAW264.7細胞系中,阿司匹林通過抑制NF-κB系統(tǒng)(P65、P50、IKB-a)和MAPKS系統(tǒng)(P38、C-JNK和ERK)通道的激活來抑制破骨細胞的生成，從而發(fā)揮治療骨質疏松的作用，且在一定范圍內和阿司匹林濃度呈正相關。

3 小結

大量動物體內試驗及離體實驗研究表明，阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質疏松癥療效肯定，主要表現(xiàn)為阿司匹林可提高去勢大鼠骨密度(BMD)值，顯著改善骨組織形態(tài)學、骨生物力學、骨代謝生化指標、骨代謝密切相關的細胞因子水平，影響骨質疏松發(fā)生機制的信號通路轉導。且阿司匹林治療骨質疏松具有雙向良性調節(jié)作用，既可達到與外源性雌激素相同的效果，又可避免外源性雌激素過量所出現(xiàn)的副作用[26]。

近年來，阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質疏松的實驗雖然取得了較大進展，但尚存在以下問題：第一，阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質疏松的作用機理尚未完全闡明，目前已從骨代謝、細胞因子水平及破骨細胞相關標志基因表達水平等方面對其作用機制做了初步探討，下一步可繼續(xù)從破骨細胞及成骨細胞相關信號通路、基因水平等方面入手進行更深入的研究，以揭示阿司匹林促進骨形成、抑制骨吸收的效應機制。第二，仍需進一步通過流行病學確定阿司匹林治療骨質疏松的劑量多少及療程多長才能達到有佳療效。從而為阿司匹林這一老藥治療絕經(jīng)后骨質疏松癥提供更多的研究基礎。