腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6與骨代謝的研究進展

張群燕 郭郡浩 蔡輝

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京 210002

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF6)是細胞內(nèi)信號傳導通路上的關(guān)鍵接頭蛋白。因其能直接和CD40、IRAK以及NF-κB受體激活蛋白(receptor activator of NF-κB，RANK)相結(jié)合，進而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、JNK/p38、AP-1通路，影響細胞的生成、增殖、分化和死亡而備受關(guān)注[1,2]。骨代謝是骨組織不斷進行改建活動的一個復雜過程，包括骨吸收和骨形成兩個方面。近年來，有關(guān)TRAF6在骨代謝方面的研究較多，其結(jié)果頗具爭議，現(xiàn)就TRAF6在骨代謝中的研究進展作一綜述。

1 TRAF6蛋白結(jié)構(gòu)及生物學功能

1994年，Rothe等利用酵母雙雜交技術(shù)和免疫沉淀反應發(fā)現(xiàn)了兩種能與TNFRⅡ特異性結(jié)合的胞內(nèi)信號接頭蛋白并命名為TRAF1、TRAF2，隨后在哺乳動物中又發(fā)現(xiàn)幾種TRAFs蛋白，分別為TRAF1-TRAF6，并統(tǒng)稱為TRAF家族(tumor necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs)。

TRAFs蛋白在進化上非常保守，且有著十分相似的結(jié)構(gòu)特征[3]，即①TRAF分子C端都含有一個約200個氨基酸殘基的TRAF結(jié)構(gòu)域，主要接受外來信號。其中，TRAF又分為TRAF-N和TRAF-C兩部分，TRAF-C可與不同受體蛋白胞內(nèi)段的TRAF結(jié)構(gòu)域或胞漿內(nèi)其他含有TRAF結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合，依賴TRAF-N端的環(huán)-環(huán)α螺旋結(jié)構(gòu)(coiled-coil)形成同源或異源二聚體或多聚體。雖然有文獻將新的蛋白質(zhì)被命名為TRAF7[4]，但這種說法是有爭議的，因為該蛋白不具有定義TRAFs的TRAF同源結(jié)構(gòu)域。②除了TRAF1以外，TRAF分子N端依次有三個域，第45～106位是含有兩個鋅原子、7個半胱氨酸的環(huán)指模序(ring finger motif)，第110～264位有5到7個鋅指(zinc finger，ZF)結(jié)構(gòu)域，第287～342位有螺旋輪結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)將膜上的信號傳導至下游，激發(fā)一系列信號通路，從而發(fā)揮不同的生物學功能[5]。

1996年，Ishida等[6]使用cDNA文庫的酵母雙雜交系統(tǒng)和篩選技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TRAF6介導CD40參與NF-κB活化的信號轉(zhuǎn)導；隨后，Cao等[7]發(fā)現(xiàn)TRAF6可以與白細胞介素受體相關(guān)激酶(IL-1R-associated kinase，IRAK)綁定結(jié)合，在配體的刺激下，接頭蛋白MyD88通過保守的C端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域TIR(Toll/IL-1R homology region)被募集到IL-1R或TLR復合體上，參與NF-κB活化的信號轉(zhuǎn)導。

現(xiàn)已證實，人TRAF6基因定位于11p13，編碼的蛋白質(zhì)為511個氨基酸殘基，是一種泛素連接酶，廣泛分布在腦、肺、肝、骨骼肌、腎臟等組織中，心、脾、睪丸也有少量表達。結(jié)構(gòu)上由于N端獨特的TRAF-C結(jié)構(gòu)能結(jié)合不同的蛋白分子，使TRAF6既參與CD40的信號轉(zhuǎn)導又參與IL-1R/TLRs的信號轉(zhuǎn)導[2,8]，是TRAFs家族中唯一一個可以直接和CD40、IRAK以及NF-κB受體激活蛋白(receptor activator of NF-κB，RANK)相結(jié)合的銜接蛋白，但所介導的結(jié)果似乎相似，皆可激活NF-κB[9,10]。在多種病理生理如先天免疫和適應性免疫，骨代謝和淋巴結(jié)的發(fā)展，乳腺/皮膚和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成等過程中發(fā)揮著重要作用。

2 TRAF6與破骨細胞

破骨細胞(osteoclast，OC)是來源于骨髓單核/巨噬細胞系經(jīng)單核巨噬細胞系的前體細胞分化為具有抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)陽性的多核細胞，在骨營養(yǎng)激素和骨微環(huán)境產(chǎn)生的局部因子調(diào)節(jié)下，在骨吸收部位分化為破骨細胞，行使骨吸收的功能?，F(xiàn)已證實，核因子κB受體激動劑(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)是破骨細胞分化與成熟過程中的重要因子，成骨細胞合成的NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand)與破骨前體細胞上的RANK的結(jié)合后，激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，使破骨細胞分化加快，凋亡抑制，最終導致破骨細胞數(shù)量增多，骨吸收功能亢進。因此，RANKL/RANK通路也被認為是介導破骨細胞分化成熟的最重要的信號通路[11,12]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6作為細胞內(nèi)信號傳導的重要接頭蛋白在RANKL/RANK介導的破骨細胞分化與成熟過程中起著不可或缺的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，RANK與RANKL結(jié)合后，促使RANK胞內(nèi)區(qū)與TRAF分子C端相結(jié)合，而能與RANK結(jié)合的TRAF有TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TRAF6，且不同類型的TRAF與RANK不同的氨基酸位點結(jié)合[2]。Armstrong等[13]用敲除不同TRAF結(jié)合位點的突變將RANK cDNA的不同區(qū)域轉(zhuǎn)染至無RANK的造血祖細胞的方法，發(fā)現(xiàn)RANK的胞漿段含有多個TRAF結(jié)合區(qū)，其近膜端基序結(jié)合TRAF6，C端區(qū)域結(jié)合TRAFs 1、2、3、5。且TRAF6是維持破骨細胞骨架形成和骨吸收作用所必須，其作用不能由TRAF2和TRAF5替代。

Kadono等[14]發(fā)現(xiàn)RANK在胞內(nèi)有3個TRAF6部位，且這三條通道均能獨自介導RANK信號途徑。Ye等[2]發(fā)現(xiàn)RANK與TRAF6的結(jié)合部位有一種Pro-X-Glu-X-X-芳香族/酸性殘基的序列，此序列在CD40和IL-1R的TRAF6的結(jié)合部位中也存在，而在其余TRAF蛋白中存在明顯差異，也許正是這種差異導致了TRAF6與相關(guān)結(jié)合膜蛋白如RNAK結(jié)合的特異性。

Kobayashi等[15]發(fā)現(xiàn)，將缺少環(huán)指結(jié)構(gòu)的突變TRAF6蛋白分子導人TRAF-/-的小鼠破骨細胞前體細胞內(nèi)，在M-CSF和RANKL的刺激下，前體細胞只能分化為抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)陽性的破骨細胞樣細胞(osteoclast-like cell，OCL)，而無法形成肌動蛋白環(huán)，即無法發(fā)揮骨吸收作用。用同樣的方法還發(fā)現(xiàn)，缺少第二和第三位鋅指結(jié)構(gòu)的TRAF6蛋白，無法使破骨細胞前體細胞分化為OCL。

由此可見，RANK與TRAF6的結(jié)合是RANKL/RANK信號下傳的第一步，在破骨細胞的分化和成熟中每一個位點的結(jié)合都是十分重要的。TRAF6的C端與RANK結(jié)合后，誘導其位于N端募集胞漿內(nèi)其它含有TRAF6的蛋白分子，使TRAF6三聚化，形成RANK-TRAF6-轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TAK1)結(jié)合蛋白2(TAB2)-TAK1復合物，誘導TAK1活化[16]，進而激活NF-κB、c-Src以及促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)下傳RANKL/RANK信號發(fā)揮調(diào)節(jié)OC數(shù)量及活性的作用；另一方面某些因子也經(jīng)TRAF6發(fā)揮作用，如TNF可經(jīng)TRAF6促進OC生成，而白介素(IL-1)通過TRAF6抑制OC凋亡[17]。所以TRAF6在RANKL的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導中起樞紐作用。

Lee等[18]發(fā)現(xiàn)，RANKL/RANK結(jié)合后首先以振蕩模式瞬時招募TRAF6綁定，隨后，TRAF6在RANKL刺激下以非振蕩模式與RANK相互作用。這表明RANK振蕩募集TRAF6可能介導了RANKL誘導的MAPK信號通路的激活。在M-CSF和RANKL的刺激下，TRAF6缺失(TRAF6-/-)的破骨細胞前體不能分化為破骨細胞，說明TRAF6在前體細胞向OC和巨噬細胞分化的分支點發(fā)揮重要作用。TRAF6-/-細胞中RANKL誘導的p38活化不明顯，而RANKL誘導的ERK和JNK活化以及M-CSF誘導的ERK、p38和JNK活化并不受影響；進一步研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6-/-細胞中活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1)和c-Fos的表達下調(diào)，NFATc1、c-Fos以及p65向核內(nèi)轉(zhuǎn)運受阻。表明RANKL/RANK/TRAF6信號通路通過持續(xù)激活p38后可上調(diào)破骨細胞轉(zhuǎn)錄因子的和促進破骨細胞分化[19]。

Yen等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的刺激下，人源單核細胞和小鼠RAW264.7細胞系p38 MAPK、JNK、ERK的磷酸化明顯增強，骨吸收活性明顯；但被TRAF6 siRNA轉(zhuǎn)染后，前體細胞只能分化為TRAP陽性的OCL，p38 MAPK、JNK、ERK磷酸化受抑制，NFATc1表達下調(diào)，骨吸收活性明顯降低，且在TRAF6-/-骨髓巨噬細胞，TRAIL誘導破骨細胞分化作用被完全抑制，表明TRAF6依賴的信號傳導不僅在TRAIL誘導破骨細胞分化作用中起主要作用，還參與破骨細胞活化，并可以通過TRAF6等除RANKL以外其它TNF超家族分子來調(diào)控RANK信號傳導。

Nakamura等[21]發(fā)現(xiàn)，前破骨細胞在IL-1刺激下，TRAF6可與c-Src作用形成TRAF6/c-Src分子復合物，使p130Cas、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2、c-Src磷酸化，誘導其骨架重構(gòu)分化為破骨細胞。c-Src缺如的OCL免疫共沉淀法將無法檢測到TRAF6復合物的形成，進而影響肌動蛋白環(huán)和胞膜的微皺褶形成障礙，使OCL無法正常黏附于骨表面并發(fā)揮骨吸收的作用。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子聯(lián)合核因子-κB激酶(TRAF family member-associated NF-κB activator，TANK)可與TRAF6結(jié)合介導NF-κB通路負向調(diào)控破骨細胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，在RANKL誘導的破骨細胞前體細胞中，TANK mRNA 和蛋白均出現(xiàn)低表達。而體外TANK-/-小鼠出現(xiàn)明顯的骨小梁損失，骨皮質(zhì)密度增加，進一步檢測發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)TRAF6泛素化上升，經(jīng)典途徑NF-κB生成增多，破骨細胞的轉(zhuǎn)化明顯增加[22]。

TRAF6與RANK結(jié)合被泛素化后，形成RANK-TRAF6-轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TAK1)結(jié)合蛋白2(TAB2)-TAK1復合物，最終激活NF-κB信號通路。NF-κB是破骨細胞分化所必需的細胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB1/2雙基因敲除小鼠與RANKL/RANK雙基因敲除小鼠的破骨細胞分化障礙相似，它們的破骨前體細胞都停止在分化階段，不能夠表達破骨細胞分化的重要作用因子，如：TRAP、組織蛋白酶K、降鈣素受體等，使破骨前體細胞數(shù)量增加，但是凋亡沒有增加；且由于缺少破骨細胞導致的骨骼硬化癥[23]。由此可見，RANK與TRAF6的結(jié)合在破骨細胞形成的每一步中都是十分重要的。

3 TRAF6與成骨細胞

成骨細胞(osteoblast，OB)是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細胞增殖，細胞外基質(zhì)成熟、細胞外基質(zhì)礦化和成骨細胞凋亡4個階段。過去的幾年內(nèi)，有關(guān)成骨細胞的分化、成熟調(diào)控的分子機制不斷被完善，如Wnt蛋白、骨形成蛋白(bone morphogenic protein，BMP)、成纖維生長因子、胰島素樣生長因子等，以及抑制成骨細胞分化增殖的細胞因子如腫瘤壞死因子等[24]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6參與TGFβ家族成員引起的TAK1-MAPKs的激活，在成骨細胞的分化成熟等方面起著重要作用[27]。

BMPs屬轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員，是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的多功能蛋白，在各種器官發(fā)生(包括骨和軟骨的形成)中起重要作用，其主要通過結(jié)合并激活細胞膜上特異性受體，通過Smads依賴性和Smads非依賴性兩種途徑傳遞信號，促進MSCs向OB分化。研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6過表達降低Smad1蛋白穩(wěn)定性抑制Smad1的表達，進而抑制成骨細胞的分化和骨礦化；而TRAF6-/-小鼠上調(diào)Smad1的表達，說明TRAF6可以通過BMP-Smad1通路調(diào)控OB的分化。進一步研究顯示，TRAF6不能促進OB的增殖，但是其通過Runx2和Osx的表達抑制成骨細胞的分化，且該抑制作用可以被Smad1逆轉(zhuǎn)，表明TRAF6與成骨細胞的分化關(guān)系密切，該作用通過Smad1介導，調(diào)節(jié)BMP通路抑制OB的分化[25,26]。

RUNX2是轉(zhuǎn)錄因子RUNXX家族成員之一，作為成骨細胞的特異轉(zhuǎn)錄因子，對骨組織的形成和重建起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)前體細胞Runx2在TAK1-p38蛋白軸Smads非依賴性途徑的激活是必不可少，質(zhì)子泵抑制劑蘭索拉唑可以與泛素C末端結(jié)合抑制去泛素酶CYLD活性進而增強TRAF6的多泛素化，上調(diào)RUNX2的表達，隨后RUNX2通過與成骨細胞特異性順式作用元件2(OSE2)相結(jié)合刺激堿性磷酸酶(ALP)的表達，從而間接刺激間充質(zhì)干細胞向OB分化[28]。

目前相關(guān)研究主要集中在破骨細胞，有限的研究尚不能確定TRAF6表達與成骨細胞之間的聯(lián)系，進一步深入研究兩者之間的關(guān)系，也許在骨代謝性疾病的防治方面可開辟一條可行的新途徑。

4 TRAF6與骨代謝性疾病

Lomaga等[29]發(fā)現(xiàn)4周齡TRAF6-/-小鼠表現(xiàn)為嚴重骨骼硬化癥如長骨特別是股骨長度變短、基底部變寬，扁骨的骨骼結(jié)構(gòu)和形態(tài)顯示正常，X平片提示骨密度增加以及沒有門牙和臼齒等牙齒萌出缺陷表現(xiàn)。

李霞等[30]選用TRAF6-/-的大鼠，發(fā)現(xiàn)牙胚發(fā)育過程中TRAF6呈動態(tài)時空表達模式：從牙板開始增厚時牙板上皮細胞就表達TRAF6，尤其鐘狀早期內(nèi)釉細胞及鐘狀晚期(硬組織形成期)成釉上皮細胞質(zhì)TRAF6強陽性表達；牙乳頭間充質(zhì)細胞及成牙本質(zhì)細胞在鐘狀早期時TRAF6呈陽性表達，至硬組織形成期成牙本質(zhì)細胞質(zhì)強陽性表達TRAF6，而牙乳頭間充質(zhì)細胞變?yōu)槿蹶栃员磉_，至出生后7d時未見表達。表明TRAF6可能在牙胚細胞增殖、分化和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

Zhu等[31,32]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜組織TRAF6表達與血清骨代謝標志物I型前膠原氨基端前肽(PINP)、骨鈣素降解產(chǎn)物(N-MID.OC)呈正相關(guān)(r=0.381，0.345，P<0.05)。提示滑膜TRAF6表達增加可能與RA代償性骨形成增加有關(guān)，TRAF6可能通過介導滑膜炎癥參與了RA的骨代謝失衡。具體機制可能與TRAF6在破骨細胞膜與RANK結(jié)合并激發(fā)了TRAF6的募集并進一步激活NF-κB和NFATcl促使破骨細胞的形成有關(guān)。

Liu等[36]通過培養(yǎng)人關(guān)節(jié)軟骨細胞(從骨關(guān)節(jié)炎患者收獲)，用IL-1β刺激的軟骨細胞TLR4和下游的信號分子MyD88和TRAF6顯著上調(diào)，以及由此刺激TNFα的合成和NF-κB的活化均有明顯增加。表明TRAF6可能在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨病變過程中發(fā)揮重要作用。

p62/SQSTM1是一個由SQSTM1編碼的多功能泛素結(jié)合蛋白，其一級結(jié)構(gòu)序列中有一個可以與TRAF6結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，在RANK誘導信號中，p62蛋白通過與TRAF6聚集形成p62-TRAF6信號復合物，與非典型蛋白激酶C(aPKC)蛋白相互作用，通過NF-κB抑制物的激酶(IKKb)的磷酸化，調(diào)節(jié)NF-κB的活化，促進破骨細胞的形成及活化，在骨代謝的調(diào)節(jié)及骨質(zhì)疏松的形成中發(fā)揮重要的作用[34]。SQSTM1基因突變是在Paget骨病患者中檢出率最高的基因突變，有研究發(fā)現(xiàn)，p62蛋白的變異減弱了p62與TRAF6的結(jié)合能力，導致了NF-kB信號通路的增強以及增加了破骨祖細胞對RANKL、TNF的敏感性[35]，因此調(diào)控TRAF6有可能成為研究和治療Paget骨病的一種方法和手段。

5 總結(jié)與展望

骨代謝是骨組織不斷進行改建活動的一個復雜過程，其中破骨細胞發(fā)揮吸收骨基質(zhì)的功能，而成骨細胞起著合成骨基質(zhì)的作用，二者相輔相成，缺一不可。隨著骨免疫學的發(fā)展，研究破骨細胞/成骨細胞的分化成熟與免疫炙手可熱。TRAF6是近年來在骨代謝及骨免疫中起重要調(diào)節(jié)作用的接頭蛋白，其不僅參與CD40、IL-1R/TLRs信號轉(zhuǎn)導激活的NF-κB和JNK信號通路調(diào)控DCs細胞、B細胞的成熟、增殖和分化，還介導RANKL/RANK通路直接或間接作用于骨分化，特別是對破骨細胞的分化、成熟、活化等各個方面都有影響，研究亦較多和成熟，而有關(guān)成骨細胞相關(guān)研究有待進一步開展，以期為骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療開拓新的思路。