微小RNA和長鏈非編碼RNA作為心臟疾病生物標志物的研究進展

李芳卉、李東澤、張蜀、趙立志綜述，曾銳審校

綜述

微小RNA和長鏈非編碼RNA作為心臟疾病生物標志物的研究進展

李芳卉、李東澤、張蜀、趙立志綜述，曾銳審校

人類基因組中有超過85%的基因轉錄為核糖核酸（RNA），但只有約2%的基因轉錄成編碼蛋白質的信使核糖核酸(mRNA)，其余均為非編碼RNA（ncRNA）。ncRNA根據長度分為短鏈ncRNA[如微小RNA (miRNA）]和長鏈ncRNA（lncRNA）。目前研究發現ncRNA可以通過不同的機制調節心臟功能，同時其調節異常與心血管疾病的發生和發展有很大聯系。研究顯示，循環血中某些ncRNA穩定性良好,其表達水平異常變化與心血管疾病的病程進展密切相關，提示循環血中的ncRNA具有作為心臟疾病生物標志物的潛在價值。故本文對循環血液中miRNA和lncRNA作為心臟疾病生物標志物的進展進行綜述。

綜述；微RNAs；長鏈非編碼RNA；心血管疾病

非編碼RNA（ncRNA） 是指轉錄組中不編碼蛋白的功能性RNA分子，分為兩類：短鏈ncRNA [如微小RNA （miRNA，核苷酸數小于200）]和長鏈ncRNA（lncRNA，核苷酸數大于200）。近年來，在基因組學中發現，部分ncRNA在人類基因調控中發揮著重要作用，包括心血管疾病的發生和發展[1，2]。研究顯示，循環血中某些ncRNA穩定性良好,其表達水平異常變化與心血管疾病的病程進展密切相關，提示循環血中的ncRNA具有作為心臟疾病生物標志物的潛在價值。本文對循環血液中miRNA和lncRNA在心臟發育中的作用及作為心臟疾病生物標志物的進展進行綜述。

1 miRNA和lncRNA 概述

1.1 miRNA

miRNA是一類由內源基因編碼的在進化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，長度約為20～24 nt 。miRNA通過完全或不完全互補配對的方式結合于靶 基因，從而導致靶基因的降解或翻譯抑制。人體內已發現2000多個miRNA，調節60%的人類基因[3]。

大多數miRNA在RNA聚合酶II的作用下轉錄成初級miRNA（pri-miRNA）[4]。在核糖核酸酶III Drosha酶與RNA結合蛋白協同作用下，pri-miRNA加工成為具有莖環結構的pre-miRNA。隨后，pre-miRNA由細胞核轉運至細胞質，在Dicer酶和輔助因子TRBP協同作用下，pre-miRNA加工成為成熟miRNA雙鏈。雙鏈miRNA在解螺旋酶的作用下分離,一條成為功能性miRNA，另一條被降解。

1.2 lncRNA

lncRNA是長度大于 200 個核苷酸的ncRNA。人類lncRNA數量預計與蛋白質編碼基因的數量相似[5]。根據lncRNA 與蛋白質編碼基因的位置關系，分為以下幾類[6]： （1）基因間 lncRNA；（2）基因內 lncRNA；（3）雙向 lncRNA；（4）內含子 lncRNA；（5）正義 lncRNA；（6）反義 lncRNA。

lncRNA通常有較長的序列，經過剪接，具有polyA尾巴與啟動子結構，分化過程中有動態的表達與不同的剪接方式，可以與靶基因建立核域并且結合蛋白質從而形成RNA-DNA-蛋白質復合物[6]。因此，lncRNA可以通過更多樣的機制來抑制或激活基因的表達[7]。lncRNA參與調節多種重要的細胞活動，如基因表達、基因組印記（H19）、招募染色質修飾物、調節X染色體失活（XIST）、蛋白質活性和蛋白質折疊等[8]。

2 miRNA

2.1 miRNA在心臟中的生物學功能

在心臟發育過程中，miRNA動態表達，調整了心臟重要基因的表達水平，在促進心力衰竭，心肌肥厚，纖維化和缺血/再灌注損傷的基因表達變化中起著關鍵作用[9]。研究發現，Dicer酶基因敲除小鼠血管新生與形成以及心臟發育均受阻。敲除Dicer的小鼠心臟特異性 miRNA 表達普遍下降，小鼠出生后死于擴張型心肌病和心力衰竭[10，11]。這些研究提示miRNA對心血管系統的發育和生理功能的維持方面是必不可少的[12]。

心肌收縮力取決于肌球蛋白重鏈（MHC）基因的表達。MHC表達從快收縮肌球蛋白（a型）向慢收縮肌球蛋白（b型）的轉化是心血管疾病的一個重要標志。miR-208a 和 miR-208b 是心臟特異性表達 miRNA，分別由a-MHC （Myh6） 和b-MHC （Myh7）的內含子編碼。奧爾森實驗室對miR-208突變型小鼠與野生型小鼠進行比較[13]，得出miR-208通過一種涉及甲狀腺激素的機制來特異性增強b-MHC的表達，對心肌肥大信號的表達起著關鍵作用。

miR-1和miR-133是兩個高度保守的、特異性表達于肌肉組織的 miRNA，成簇存在于同一個多順反子內，參與肌肉形成、心臟發育和心肌肥厚的發生[14]。在心肌肥厚模型中觀察到miR-1和miR-133水平的下降[15]。miR-1抑制HAND2的表達，從而抑制心肌細胞增殖，促進心肌細胞分化，減輕心肌細胞的肥大[16]。利用轉基因小鼠模型做進一步研究，發現miR-133調節B1腎上腺素能途徑的多個組件并且在心力衰竭時起到保護作用[17]。miR-1通過影響鉀離子通道亞單位 Kir2.1 和心臟間隙鏈接通道蛋白Cx43而參與心臟電傳導的調節[18]。Vacchi-Suzzi等[19]通過對miRNA測序，研究不同物種（大鼠，狗和猴）的心臟特異性miRNA，確定了心臟特殊結構中的保守miRNA的特征；利用原位雜交技術確認了miR-1，miR-125b-5p和miR-204的表達模式。

2.2 循環miRNA的生物標志物作用

血漿中存在大量的核糖核酸酶（RNAses），當miRNA與血漿結合后就會被迅速降解[20]，然而循環血液中的某些miRNA在一定時間內并不受其影響，仍可保持較好的穩定性和較高的表達量，提示循環血液中測量到的miRNA是通過各種載體而穩定存在的。綜合已有的研究分析，循環miRNA可能通過如下途徑穩定存在：（1）胞外囊泡根據大小，胞外囊泡被分為外泌體 （Exosomes） 和微泡 （Microvesicles） 。胞外囊泡的成分包括DNA、mRNA、ncRNA、蛋白質和脂質。當外周環境變化時，胞外囊泡的成分也會發生相應的改變[21]。胞外囊泡通過交換信號分子來介導細胞間的通信。（2）蛋白質復合物：對體液miRNA進行超速離心法純化后發現，部分miRNA通過形成miRNA-蛋白質復合物而免遭破壞。進一步研究得到，miRNA-蛋白質復合物的形成與argonaute-2（Ago2）酶有關[22]。近期研究表明，miRNA可以主動或被動地從細胞中釋放。

對不同類型心臟病患者的血液進行檢測，所得出miRNA的含量水平有所不同。對急性心肌梗死（AMI）中心臟特異性循環miRNA進行研究顯示，AMI患者心肌梗死后1 h內，血漿miR-208a水平升高；4h內，血漿miR-1、miR-133和miR-499水平升高；但在健康對照組、腎梗死患者組、與非AMI胸痛患者組的血漿中未發現升高[23]。因此，miR-208a是一個具有高度靈敏性和特異性的AMI生物標志物。對miR-208b進行研究，顯示其在AMI患者血漿中增加了1600倍[24]。在對AMI患者進行了3個月的治療后，miRNA峰值發生逆轉，下降至低于檢測極限[25]。以上研究結果表明miR-1, miR-133a, miR-499, miR-208a和miR-208b具有作為心血管疾病心肌損傷的生物標志物的潛能。

3 lncRNA

3.1 lncRNA在心臟中的生物學功能

雖然對lncRNA功能和作用機制的研究尚處于起步階段，但已有的一些研究提示lncRNA作為一種新的生物調節模式與心血管疾病有著密切的聯系。

心臟發育研究表明，胚胎在不同發育階段lncRNA的表達存在較大差異，很可能是參與正常心臟發育的新機制[26]。在中胚層發現并與小鼠心臟發育相關的兩個lncRNA—— Bvht（brave heart）和 Fendrr（Foxf1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA）顯現出尤為重要的作用。Bvht在小鼠胚胎干細胞和新生小鼠心肌細胞中高度表達。利用核糖核酸干擾（RNAi）對小鼠胚胎干細胞中Bvht進行敲除，發現Bvht的缺失影響了心肌特異性基因的表達，改變了心肌細胞的發育。Fendrr是一個側中胚層特異性的lncRNA，控制著中胚層的分化，通過連接組蛋白重構復合體PRC2和TrxG/MLL使其分化成為心臟和體壁[27]。對胚胎細胞中Fendrr進行完全敲除，出現由于心臟功能損傷導致胚胎致死的現象，同時會影響體壁的發育。進一步的機制研究發現，Fendrr在表觀水平調控許多重要基因的表達，例如GATA-6、PRC2等[26]。

幾個全基因組研究證實了lncRNA和心血管疾病之間的其他聯系。lncRNA心肌梗死相關轉錄本（MIAT）的改變與心肌梗死的易感性有關[28]。心肌細胞凋亡相關lncRNA（CARL）通過“海綿”作用與miR-539結合和分離抑制線粒體分裂和凋亡改善心肌缺血-再灌注損傷后的心肌梗死。 INK4 基因座反義lncRNA（ANRIL）與動脈粥樣硬化性血管病敏感性有關[29]。另外，ANRIL離體敲除系統表示ANRIL在葡萄糖和脂肪酸代謝調控基因的表達中起著重要的作用[30]。肌球蛋白重鏈相關RNA轉錄子（Myheart或Mhrt）位于心肌細胞核，并在心臟負荷過程中調節病理性心肌肥大和心力衰竭[31]。心肌肥厚相關因子（CHRF）可以作為一個“分子誘餌”或“miRNA海綿”來隔絕miR-489，其中包括對靶點髓樣分化初始應答基因88（Myd88）進行轉錄抑制，調控心肌肥厚。

3.2 循環lncRNA的心臟生物標志物作用

lncRNA可能以胞外囊泡或蛋白質復合物形式進入人體循環系統中，形成循環lncRNA穩定而廣泛存在于體液中。新近研究發現，lncRNA的表達具有組織特異性，可作為心血管疾病早期診斷的生物標志物。

Kumarswamy等[32]對有/無左心室重塑患者血漿樣品中的lncRNA進行篩查，發現lncRNA uc022bqs.1 （LIPCAR）是心肌梗死后心肌重塑的相關因素。慢性收縮性心力衰竭患者血漿中LIPCAR異常表達，且與其心血管病死率密切相關，可以作為一種新型的心肌重塑標志物。另一項研究使用PCR技術量化了心肌梗死患者全血樣本中五種lncRNA（aHIF，ANRIL，KCNQ1OT1、MIAT，MALAT1）的水平[33]。顯示，除MIAT失調外，aHIF、KCNQ1OT1和MALAT1增加，ANRIL減少。lncRNA的表達譜在ST段抬高型和非ST段抬高型心肌梗死患者之間也有所不同。

Yang等[34]對進展型心衰和行支架手術的左心室組織進行研究，發現其基因轉錄本異常表達，并且與mRNA和miRNA不同的是，lncRNAs的表達可以區別不同原因所致的心力衰竭，在行支架手術后的組織中異常表達更明顯。

Xu等[35]采集了20 例心房顫動患者的血液樣本，應用人類 lncRNAs 陣列進行分析，發現有153個miRNA 和177個lncRNAs差異性表達，其中lncRNAs NONHSAT040387 上調和 NONHSAT098586下調最為顯著，應用 GO 和 KEGG 信號通路分析，對lncRNAs NONHSAT040387 和 NONHSAT098586在心房顫動的調控功能做進一步探索，結果發現蛋白質異源二聚體活性和氧轉運體活性可能參與心房顫動發病機制，但與這兩個 lncRNAs 表達和功能的關系有待進一步研究。

以上研究均表明lncRNA在心血管疾病的發病機制中有著重要的作用，但是其具體的作用機制還需進一步的研究來闡明。

4 總結與展望

循環microRNA水平與人類心血管疾病的關聯很大，但是循環lncRNA作為生物標志物的研究才剛剛起步。目前對于ncRNA功能研究方法學較為成熟，能夠對其在心血管疾病中的功能進行系統研究，但是作為生物標記物，需要更多的大樣本臨床研究進行驗證，同時能否解決循環中ncRNA的快速檢測等問題，也將影響ncRNA作為心血管疾病診斷和評估預后的高效生物標志物的臨床運用。

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2017-04-06）

（編輯：王寶茹）

四川省衛生和計劃生育委員會科研項目（16PJ305）；瀘州-西南醫大聯合基金項目（2016LZXNYD-J04）

610041 四川省成都市，四川大學華西臨床醫學院華西醫院 急診科（李芳卉、李東澤、張蜀），心臟內科（曾銳）；西南醫科大學第二附屬醫院 心腦病科（趙立志）

李芳卉 住院醫師 學士 主要從事心血管疾病基礎和臨床研究 Email: 551801146@qq.com 通訊作者：曾銳 Email:zengrui_0524@126.com

R54

A

1000-3614（2017）11-1131-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.024