豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術的研究進展

胡玲玲，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，韋冠東，龍冬梅，石遠菊，楊 偉，葉 麗

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術的研究進展

胡玲玲，湯德元*，曾智勇，王 彬，黃 濤，韋冠東，龍冬梅，石遠菊，楊 偉，葉 麗

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬繁殖與呼吸綜合征又稱豬藍耳病，是嚴重危害養豬業的傳染病之一，2006年我國自南向北大面積暴發高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，目前該病在我國有的地區又出現不斷發病的事態，在整個防控過程中快速準確的診斷方法與技術對診斷豬繁殖與呼吸綜合征至關重要。本文主要從豬繁殖與呼吸綜合征的病毒的分離鑒定、血清學診斷方法和分子生物學診斷等方法及技術的新研究進展進行了綜述，以期為豬繁殖與呼吸綜合征的診斷與防控提供一定的理論支持和參考依據。

豬繁殖與呼吸綜合征；病原學診斷；血清學診斷；分子生物學診斷

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以感染妊娠母豬晚期流產、產死胎、早產、木乃伊胎和弱胎，各種年齡豬（特別是仔豬）呼吸障礙、厭食為特征的高度傳染性疾病，在美國最早發生該病。荷蘭人Wensvoot等1991年首次于發病仔豬和母豬體內分離到了該病毒，當時被稱為Lelystad病毒。隨后很多國家也相繼分離到此病毒。郭寶清等(1996)首次從國內有相似癥狀發病豬群中分離出豬繁殖與呼吸綜合征病毒，從此代表該病在我國的存在。楊漢春[1]闡述PRRSV有2個血清型，即美洲型（代表毒株為VR-2332株）和歐洲型（代表毒株為LV株），歐洲和美洲分離株毒株之間存在明顯的抗原差異性。在對我國分離毒株的基因組進行分析表明，目前在我國流行的毒株均屬于美洲型，并沒有發現和分離到歐洲型毒株。湯德元等[2]分析了美洲型的PRRSV，其可分為4個亞群，我國現今流行的PRRSV毒株屬于四個亞群中的3個亞群，即以PRRSV BJ-4株為代表的屬于1亞群；以HB-1(sh)/2002、CH-la和HB-2(sh)/2002株為代表的屬于2亞群；以BJ-13為代表的屬于4亞群。本病傳播迅速，尤其在養豬技術進步和經濟發達國家，由于豬群密集、流轉頻繁，更易引起流行。目前，各國對本病進行了大量深入的研究。PRRS可危害各種日齡階段的豬，并且臨床表現多樣，同時引起細菌病或病毒病等繼發感染，導致臨床癥狀的復雜化。因此，僅根據臨診癥狀及流行病學特點很難做出診斷，此病的診斷必須借助于實驗室診斷技術。本文主要對近年來實驗室對豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法的進展進行綜述，以期為豬繁殖與呼吸綜合征的診斷與防控提供一定的理論支持和參考。

1 病毒的分離鑒定

病毒的分離鑒定是目前病毒病最真實的一種診斷方法。常用于PRRSV分離的細胞主要有豬肺泡巨噬細胞（PAMS）、非洲綠猴腎細胞（MA-104、CL-2621、Marc-145等），以及克隆自Marc-145的更敏感的HS．2H細胞。但分離PRRSV歐洲株只能用PAM細胞[3]該病毒的分離可來源于血清、肺臟、肺泡灌出物、脾臟、淋巴結和扁桃體，尤其以血清和肺臟組織分離成功率最高；較易從急性感染病例豬中分離到PRRSV；據有關報道PRRSV在死胎和新生仔豬中分布情況不一致，流產在死胎脾臟和淋巴結巨噬細胞分布含量比較多，而新生仔豬則常見于肺臟。采集后的樣品應冷藏或冷凍運輸和保存，將采集的樣品經過處理后接種于長滿的單層PAMs細胞后1～4 d即可出現細胞病變（CPE），細胞最初呈現灶狀變圓、膨大，隨后皺縮，脫落形成拉網空洞。當接種于CL-2621細胞時，CPE出現得比較緩慢，需在感染后2～6 d才會侵染細胞單層。PRRSV在接種于Marc-145細胞48 h即可出現典型的CPE變化，具高度敏感性。由于致病力的不同，不同分離株在細胞培養上生長情況各異，甚至有些病毒株并不出現CPE現象，與此同時，必須同時結合間接免疫熒光試驗（IFA）和免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）等病原檢測方法進行驗證。

2 血清學診斷方法

血清學試驗是一種相對較于傳統的PRRSV診斷方法，在病毒抗原和抗體的檢測用得比較廣泛。血清學實驗有其較強的特異性，但在敏感性上有所欠缺。

2.1 中和試驗

在對PRRS V抗體進行檢測的過程，中和試驗（SN）對PRRSV的抗體特異性是很好的，但是由于中和抗體出現的時期比較晚，需在感染后4～5周才能首次檢測到VN抗體，感染后的10周達到最高，在大部分的臨床檢測PRRSV新近病例中，與IPMA、IFA、ELISA作比較其敏感都低于它們，所以SN不適用于對PRRSV感染的早期診斷。Yoon等[4]對中和試驗進行了改良，其改良內容是加入20%的豬新鮮血清增加補體的量，目的是為了提高檢測敏感性，在感染后9～11 d即可檢出較高滴度的VN抗體。但該方法也對環境、人員的技術要求高，目前也大多局限在實驗室做研究用。

2.2 酶聯免疫吸附試驗

Albina等將PRRSV接種在PAM細胞上，以制備陽性抗原和模擬抗原，首次建立了檢測PRRSV抗體的間接酶聯免疫吸附試驗（EL ISA），許多結果表明ELISA具有與IPMA一樣的特異性，并且敏感性更高，如今商品化的間接ELISA診斷試劑已在全球范圍內廣泛使用。羅長保等將ATCCVR-2332株接種Hs．2H細胞，制備抗原，以血清抗體與模擬抗原反應的d450 nm值作為標準，從而建立了用于血清中PRRSV抗體的間接ELISA方法[5]，實驗結果顯示，有著與IFA相同的特異性，更高敏感性。王剛等用差速離心法提純抗原，以NC膜做載體，成功地建立了Dot-ELISA，并與IFA具有相同的特異性，敏感性高于IFA[6]。仝利劍等建立抗體雙抗原夾心ELISA方法，利用此重組融合N蛋白建立了一種檢測PRRSV特異性抗體的雙抗原夾心ELISA，并通過與商品化試劑盒的應用比較對該方法進行了系統評價[7]。分析了來自北京、山東、河南、河北4省區多個養豬場的近300份血清，總體的特異性和敏感性都較高。就目前看來，ELISA方法快速靈敏，特異性和敏感度均較高，操作簡便，結果能自動顯示，對于大批量血清樣品的檢測也實用。

2.3 間接熒光抗體試驗

間接熒光抗體試驗與免疫過氧化物酶單層試驗具有一樣的特異、敏感性，如今在歐洲和北美的許多國家得到了普遍的使用。在我國也有自己生產的IFA和微量IFA診斷試劑盒供應。可以從感染6 d后的豬體內檢測到PRRSV抗體，在30～50 d時抗體達到峰值，隨后逐漸降低，直至4～6個月后抗體消失，但該方法需要進行細胞培養，需用倒置顯微鏡觀察，結果不能自動顯示，對所需環境和人員的要求高，不適合大規模監測；并且，IFA與IPMA只能檢測出與實驗用PRRSV抗原性相近的PRRSV分離株。

2.4 免疫過氧化物酶單層試驗

免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）方法是歷史最長的檢測PRRSV抗體的方法，在歐洲國家被普遍使用，IPMA具有較高的敏感性和特異性，能在病毒感染6 d后豬體中檢出PRRSV抗體，該方法是基于PAMs、Cl-2621、Marc-145等細胞系上進行完成的，不好的是由于母豬血清和4周齡內的仔豬血清可以與對照的巨噬細胞反應，導致背景著色，從而影響結果的判定，且結果不能自動顯示，具一定的主觀性；同時還需細胞培養和倒置顯微鏡觀察，費力費時，大規模檢測費高，也不利于推廣應用[8-9]。

2.5 乳膠凝集試驗（LAT）

王忠田等[10]利用純化的PRRSV重組M蛋白致毒乳膠制成乳膠抗原，成功地將LAT用于PRRSV血清抗體的檢測，具有良好的特異性。用LAT與IDEXX公司抗體檢測試劑盒同時對76份豬血清樣本進行檢測，結果表明LAT的特異性和敏感性均為95%，與IDEXX公司PRRSV抗體檢測試劑盒的總符合率為87%，檢出率基本一致。因LAT具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強、價格低廉且可用于現場檢測等優點，是一種適合基層檢測PRRSV血清抗體的新方法。

2.6 膠體金抗體檢測技術

崔尚金等建立豬繁殖與呼吸綜合征膠體金抗體檢測技術，運用膠體金標記純化后的PRRSV基因工程表達抗原，以一種微孔濾膜為固相載體，以紅色膠體金為標記物的檢測PRRSV抗體的膠體金免疫層析法（GICA）[21]。特異性交叉試驗證明，GICA檢測PRRSV抗體有較高的特異性，與其他方法對比檢測證實了其敏感性，生產了一批免疫膠體金試紙條，檢測36份臨床樣本，其中30份經免疫膠體金試紙條及ELISA、免疫熒光檢測均為陽性。豬繁殖與呼吸綜合征免疫膠體金抗體檢測技術的建立為檢測PRRSV抗體提供了一種快速簡便的方法。當然，目前國內一些大專院校也建立了更為方便、快速的診斷方法，如乳膠凝集試驗和間接血凝試驗，但其在敏感性、特異性和試劑的重復性、穩定性上均有待提高。

3 PRRSV的分子生物學診斷

3.1 RT-PCR檢測

PRRSV的RT-PCR檢測在許多研究及檢測診斷實驗室已普遍使用，且敏感度達到了pg水平。Suarez等建立了檢測PRRSV的RT-PCR方法，該方法敏感性好，并可檢出隱性感染。Mar-Dassi等通過設計特異性的上下游通用引物，建立了鑒別診斷北美加拿大株和歐洲株PRRSV的 RT-PCR診斷方法，該方法在組織中檢測時敏感性高于IFA敏感性。趙耘等建立的檢測PRRSV的套式RT-PCR法，其敏感性與RT-PCR法相同，且操作更簡單[11]。顧海洋等[12]根據豬高致病性藍耳病與低致病性藍耳病在 NSP2 基因上有 87 bp 連續缺失，從 NCBI 上下載 7 對豬高致病性藍耳病保守序列設計一對引物。通過 RT-PCR 方法進行檢測證明實驗室所保存的這兩株毒株分別為豬高致病性藍耳病和低致病性藍耳病，并且建立了豬高致病性藍耳病與低致病性藍耳病的檢測方法。

3.2 實時熒光定量PCR

在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術可定量PCR。實時熒光定量PCR技 術（real time fluorescent quantitativePCR，FQ-PCR） 于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它的原理是在PCR反應體系中添加合適的熒光基團，利用熒光信號的積累實時監測整個PCR進程，隨后利用標準曲線對未知目的片段進行定量分析的手段。該方法不僅實現了對DNA模板的定量，并且具有高靈敏度、特異性和可靠性更強、自動化程度高、實時性和準確性等特點，如今已普遍用于分子生物學研究和醫學研究等各類領域。

在外國，實時熒光定量PCR技術在動物疫病的臨床診斷方面應用也十分廣泛。Callahan等（2006）建立的real-time RT-PCR技術可以用于檢測豬精液、血清及各類組織中的PRRSV，省時省力且敏感度高于常規RT-PCR。Martinez等優化改良了的PRRSV SYBR Green I時RT-PCR檢測方法，具有很高的特異性和敏感性，其檢出量為101．52TCID50/樣品，并通過TM值和溶曲線分析基因型，能夠很好地鑒別美洲株和歐洲株PRRSV毒株的基因型。

王宗照等根據Genbank中的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HPPRRSV）基因組序列設計1對特異性引物，建立了基于SYBR Green I實時PCR檢測HP-PRRSV的方法[13]。結果表明，該方法能夠檢測到HPPRRSV的存在，不與其他豬源病毒發生非特異性反應。與常規PCR方法相比，兩者的符合率為100%。該方法具有快速、簡便、敏感等優點。王榮等根據Genbank發表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）M基因序列設計1對特異性保守引物，擴增位置在M基因的14744-14846位，長度為103 bp[14]。提取PRRSV的RNA，并反轉錄成cDNA，以此cDNA為模板建立了SYBRGreen I實時定量PCR檢測PRRSV的方法。并用該方法檢測送檢的臨床疑似病料，試驗結果表明，本研究建立的PRRSVSYBR Green I PCR特異性強，耗時短，操作簡單。劉長龍等為快速檢測PRRSV，針對其N蛋白基因保守序列，設計特異性引物和TaqMan探針，以體外轉錄的RNA作為標準品，設計并改良檢測PRRSV的Taq MAN熒光定量PCR方法。應用該方法檢測除豬繁殖與呼吸綜合征病毒以外的豬病病原，結果均呈陰性；針對PRRSV陽性RNA的測試敏感度可達到10拷貝，比普通PCR靈敏10～100倍，結果表明該實驗建立的PRRSV Taq Man熒光定量PCR方法具有良好的特異性、敏感性和重復性。

3.3 依賴核酸序列的擴增技術（NASBA）

NASBA即依賴于核酸序列的擴增，是一種擴增RNA的新技術，是由1對引物引導的、連續均一的、體外特異核苷酸序列等溫擴增的酶促反應過程。反應在42 ℃進行，可在2 h左右將模板RNA擴增約109倍，不需特殊的儀器。梁海霞等針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF1中編碼nsp2的基因序列設計引物，創建了NASBA方法，并聯合微孔板中液相雜交與酶標顯色反應檢測NASBA擴增產物，建立了檢測高致病性PRRSV的NASBA-ELISA[15]。瓊脂糖凝膠電泳表明，NASBA方法擴增出了特異性核酸陽性條帶。將NASBA產物RNA系列稀釋后同時進行了ELISA和Northern雜交。結果顯示，ELISA和Northern雜交最高可分別檢測到1：50和1：30稀釋的產物RNA。采用建立的NASBA-ELISA可檢測到101．83TCID50/ Ml的Hun4株PRRSV。該方法只對3株高致病性PRRSV的檢測結果為陽性，對經典株PRRSV和其他豬源病毒的檢測結果均為陰性。結果表明，NASBAELISA能夠敏感并特異地檢測高致病性PRRSV，預示NASBA在PRRSV檢測上應用前景廣闊。

3.4 原位雜交技術（ISH）

Suarez等以PRRSVRNA為模板，通過RT-PCR擴增和地高辛標記，制備了ORF7433bP cDNA地高辛探針，對試驗感染豬的肺臟、淋巴結和腎臟進行了原位雜交，檢測到了PRRSVRNA，較免疫組化具有更高的敏感性和特異性。Chueh等[16]通過制備地高辛探針，成功建立了敏感熒光原位雜交技術，該方法采用原位RNA/RNA雜合體與抗地高辛抗體堿性磷酸酶結合，再用堅固紅TR鹽/萘酚As-MX磷酸鹽顯色，用顯微鏡觀察，并認為該方法結果明顯、清晰，對PRRS臨床診斷及病毒持續感染研究有重要意義。

3.5 環介導等溫擴增技術

Notomi等開發了一種新穎的恒溫核酸擴增方法，即環介導等溫擴增 法（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（65 ℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。張躍偉等建立了熒光顯色在環介導等溫擴增（LAMP）檢測PRRSV的方法，該方法使用了針對靶序列M＋N基因的1組引物，并且能在63 ℃等溫條件下30 min內完成反應[17]。在敏感性檢測中RT-LAMP與RT-PCR都能檢測103個包含靶基因片段的重組質粒。結果說明，應用熒光顯色劑的RT-LAMP檢測方法可快速檢測PRRSV。鑫婷等[18]建立了PRRSV RTLAMP檢測方法，試驗結果表明，RTLAMP檢測方法可快速、靈敏、特異的檢測PRRSV，并適用基層和現場檢測，其他人Rovira等、Chen等也建立了類似的方法。LAMP是一種嶄新的DNA擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點，具有替代PCR方法的可能性。

3.6 基因芯片檢測技術

楊林等建立PRRSV基因芯片檢測技術，其根據PRRSV的核衣殼蛋白編碼基因序列設計了1對特異性引物P1/P2，擴增出大小為294 bp的目的條帶；再根據目的片段，設計合成4條寡核苷酸探針，其中反向引物的5′端用熒光素CY3標記[19]。以熒光標記不對稱PCR技術為基礎，通過將單鏈PCR產物與芯片雜交實現對PRRSV的檢測，建立PRRSV的基因芯片檢測方法。利用該方法對39份豬組織樣品進行檢測，表明該方法快速檢測病料組織中PRRSV是可行的，對PRRSV的快速診斷和分子流行病學調查具有重要意義。郭煥成等建立高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒nsp2缺失變異株與經典美洲型毒株基因芯片鑒別方法，設計擴增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失區域的nsp2基因片段的二重PCR引物，并設計長度為31～35 bp的美洲型毒株通用寡核苷酸探針和非缺失株相對于變異株nsp2基因缺失區域的探針，建立寡核苷酸芯片方法[20]。檢測了該方法的特異性和靈敏度，并進行初步應用。結果通過雜交模式可清楚地區分經典毒株與缺失毒株；芯片探針與豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病病毒樣品無非特異性雜交；芯片法與常規PCR法的靈敏度相近；對12份疑似高致病性PRRS豬樣品的結果與普通PCR法一致。

由于當前PRRS給世界各國生豬養殖帶來了巨大的經濟損失，嚴重威脅了生豬養殖的發展，采用高效、特異、準確的檢測技術對 PRRS進行診斷和控制有著重要的意義。而用于 PRRS檢測的技術有多種多樣，每一種檢測方法均有其自身的優點與不足，現實的生產實踐應用中應根據實際檢測需要及實驗條件等情況來選擇相應的檢測技術，從而為該病的診斷和防控措施的制訂提供一定的依據。本文較詳細地綜述了目前常用的PRRSV的診斷方法與技術，不同的技術方法從不同方面對豬繁殖與呼吸綜合征的診斷與防控提供了便利工具，大大加快了該病的防控步伐。隨著相關研究在不斷深入，許多新的診斷技術和方法還會不斷涌現，這些都必將為今后的生豬養殖產業的發展帶來更好的技術保障。

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2017-05-05）

貴州省2014年農業攻關項目資助(黔科合NY字[2014]3055號)

胡玲玲(1993-)，女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學的科研學習

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導師，主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫結合的教學科研工作。E-mail:tdyuan@163.com