5-LOX和12/15-LOX在炎癥中的功能研究進展①

黃逸馨 徐綺嬪 陶金忠 曹隨忠

(四川農業大學動物醫學院動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

5-LOX和12/15-LOX在炎癥中的功能研究進展①

黃逸馨 徐綺嬪 陶金忠②曹隨忠

(四川農業大學動物醫學院動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)，又名脂肪氧化酶、脂肪加氧酶或類胡蘿卜素氧化酶，最早發現于高等植物中，與植物的生長密切相關，隨后，在真菌、細菌與動物組織中均發現了脂氧合酶[1,2]，它們不僅能參與細胞代謝調節，調控基因的表達與細胞的增殖、分化和衰老，還能影響氧化還原平衡進而影響細胞的功能[3,4]。

目前，哺乳動物LOXs的研究多側重于分析其與細胞功能、腫瘤及癌癥的關系等[4-6]，也有學者采用基因缺失或過表達等方式研究其在炎癥中的促炎與抗炎作用[7,8]。最新研究表明，炎癥消退是一個由多種細胞和抗炎、促炎消退介質共同參與的主動程序性過程，促炎消退脂質介質(Specialized pro-resolving mediators，SPMs)在其中發揮關鍵作用，通過限制多形核中性粒細胞(Polymorphonuclear neutrophil，PMN)募集、誘導PMN凋亡以及清除組織細胞碎片等方式促進炎癥機體恢復穩態[9]，而5-LOX和12/15-LOX便是合成SPMs的關鍵酶。因此，本文綜述了5-LOX與12/15-LOX在哺乳動物炎癥的發生發展與消退過程中的重要功能。

1 LOXs的分子結構

LOXs是由單一多肽鏈組成的可溶性蛋白酶，是一種含非血紅素鐵、不含硫的過氧化物酶，可以催化含有至少兩個單獨順式雙鍵的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)生成具有共軛雙鍵的過氧化氫產物。在哺乳動物LOXs蛋白分子中，非血紅素鐵原子靠近酶中心位置，并以配位鍵與4個組氨酸側鏈和羧基末端異亮氨酸結合，形成酶活力中心的主要組成部分[10]。大多數LOXs多肽鏈上均有兩個超二級結構：較小的N端結構域和大的C末端活性中心域，前者具有較高的動態柔性，在酶氧化過程中主要調節酶分子與底物分子相互結合；后者含有非血紅素鐵原子簇，主要負責與底物分子相結合并實施催化作用[11,12]。

2 5-LOX與12/15-LOX的分類與分布

由于LOXs能氧化哺乳動物組織細胞中富含的多烯脂肪酸——亞油酸(Linoleic acid，LA)與花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)，因此，科學家最初根據LOXs催化氧化AA時氧分子插入的位置以及它們各自的氧化特性，將哺乳動物LOXs基因命名為ALOX15、ALOX15B、ALOX12、ALOX12B、ALOX5和ALOXE3，分別編碼6種功能各異的LOX。

大多數哺乳動物5-LOX相似，且僅表達于少數幾種細胞如白細胞、巨噬細胞和樹突細胞中[4]。除了ALOX15與ALOX15B，鼠ALOX12和ALOX12B與人的同源基因享有較高的保守性，并且表現出相似的酶活性。人類ALOX15基因編碼15-LOX，最初發現于網織紅細胞和未成熟紅細胞內，高表達于嗜酸性粒細胞和支氣管肺泡上皮細胞中[13]。而鼠的15-LOX因具有能將AA轉化為12S-HpETE的12-脂氧化酶反應特性，且高表達于小鼠白細胞中而被稱為12脂氧化15脂氧合酶，曾被稱為白細胞型12-LOX(leukocyte-type 12-lipoxygenase，l12LOX)。此外，兔、鼠、牛和獼猴等哺乳動物僅有ALOX15基因，卻能表達具有12脂氧化與15脂氧化雙重活性的15脂氧合酶(人類ALOX15基因只能編碼15-LOX)，至今還未能有確切的研究結果可以解釋這個現象，只是推測與mRNA翻譯后修飾有關[14，15]。

ALOX15B基因編碼15-LOX2，在皮膚與前列腺中高表達[16-18]。人類15-LOX2主要能將AA轉化為15S-HpETE，而鼠ALOX15B基因雖具有與其較高同源性，卻表現8-脂氧化活性[19]。研究表明，小鼠該基因表達的酶具有這種反應特性是由于其氨基酸序列上具有酪氨酸-組氨酸結合體，明顯區別于其他哺乳動物與人類該高度保守同源基因對應位置上一致的“人類模體”(天冬氨酸-纈氨酸或天冬氨酸-異亮氨酸)[4]。

哺乳動物12-LOX最初因分布不同被分為l12LOX和血小板型12脂氧合酶(platelet-type 12-lipoxygenase，p12LOX)。p12LOX由ALOX12基因編碼，主要表達于血小板、膠質細胞和某些腫瘤細胞中，能將AA轉化為12S-HpETE[20]。后來發現p12LOX也表達于皮膚中，能將AA轉化為12R-HpETE[21]。此外，在某些動物中，ALOX15、ALOX15B和ALOX12基因僅表達一種酶活性，因此12-LOX與15-LOX常被并稱為12/15-LOX[16，22]。

3 5-LOX和12/15-LOX在炎癥中的生物活性及功能研究

炎癥反應是一種機體對抗外界刺激產生的保護性免疫應答，能通過非特異性免疫或特異性免疫抵御病原入侵、修復組織細胞損傷[23]，5-LOX和12/15-LOX是反應中的關鍵酶。

3.15-LOX和12/15-LOX調控促炎細胞因子等介質的表達 炎癥反應中促炎介質的釋放有利于抵御外界刺激。研究發現，12/15-LOX通路能刺激炎性因子IL-6、IFN-γ、IL-12和TNF-α mRNA和蛋白的表達[8,24]，促進炎癥反應。此外，12/15-LOX催化AA生成的代謝產物12S-HETE、15S-HETE等亦具有促炎作用[7]，能直接促進細胞因子IL-1β、MCP-1等的生成，還能增強巨噬細胞的吞噬功能[25]。MCP-1在動脈粥樣硬化中能誘導單核細胞遷移，調節炎性細胞浸潤，過表達和敲除小鼠巨噬細胞中12/15-LOX基因會導致MCP-1的mRNA表達水平隨之升高或降低[7]，此外，Wuest等[26]發現ALOX15B基因在動脈粥樣硬化中起著關鍵作用。胰島素抵抗是一種炎癥狀態，Sears等[8]實驗證實12/15-LOX參與調節脂肪組織早期炎癥及高脂飲食導致的全身胰島素抵抗。不僅如此，12/15-LOX的活性還關系著樹突細胞的成熟與功能表達，進而調控特異性T細胞免疫反應[27]。可見，12/15-LOX通路不僅能直接刺激炎性細胞，促進炎性細胞因子的表達，還能通過生成相應介質來誘發炎癥級聯反應。

5-LOX在促炎反應中也發揮了重要作用，研究證實，子癇前期的發病機制與過度炎癥反應有著密切的關系，此時患者胎盤組織中5-LOX和IL-1β的mRNA表達較高[28]。Lin等[29]發現，5-LOX抑制劑能有效控制由TNF-α誘導的人滑膜成纖維細胞中IL-6以及MCP-1的表達。此外，白三烯(Leukotriene，LTs)是源于5-LOX通路的經典促炎介質[30]，在不同白細胞與其他免疫細胞中通過5-LOX或與15-LOX共同催化游離AA(磷脂酶A2作用于細胞膜磷脂而釋放)而產生[31]。LTs是重要的促炎介質，它參與了許多疾病的病理生理過程，如半胱氨酰白三烯(LTC4、LTD4、LTE4)是過敏反應中的慢反應物質成分，在支氣管哮喘、鼻炎等過敏性疾病的發病機制中占有重要地位[32]，LTB4是固有免疫應答中最強的內源性刺激因子之一，不僅能直接促進炎性反應，還可激活其他炎性細胞。總之，炎癥反應通路中5-LOX活性的強弱制約著途徑下游LTs等促炎介質的生成，控制著促炎反應進程。因此，LOXs抑制劑己成為醫學研究的新熱點。

然而，5-LOX與12/15-LOX在炎癥中不僅發揮促炎作用，還可以產生相關介質達到抗炎和促炎消退的目的。抑制它們表達的同時亦會損害其在反應中的積極作用，長期使用LOX抑制劑還可能導致細胞生物環境破壞，發展為慢性炎癥等。因此，期望通過對它們的雙重作用更深入探索發現新的治療手段。

3.25-LOX和12/15-LOX催化PUFA生成抗炎與促炎消退介質 致炎因子長期存在并持續損傷機體，易導致急性炎癥演變為慢性炎癥而造成不良后果，因此抗炎與炎癥的及時消退至關重要。慢性炎癥反應可能是由于成纖維細胞持續激活所引起，會導致組織纖維化等，Kronke等[33]在研究炎癥依賴型疾病如系統性硬化病時，采用對小鼠12/15-LOX基因敲除的方法，證實了12/15-LOX對MAPK通路的抑制以及抗纖維化的作用。PUFA是抗炎與促炎消退過程中重要的反應底物，LA與AA經15-LOX和15-LOX2氧化作用生成的產物在大量炎性模型中表現出了抗炎活性，Kumar等[34]研究表明15-LOX催化LA生成的代謝產物能通過PPAR-γ途徑抑制NLRP3炎性小體的激活，控制了炎癥反應。

急性炎癥的消退曾一度被認為是一個由于促炎因子衰減所致的被動過程，現已證實，炎癥消退不是被動的炎癥反應的終止，而是一個由多種細胞和介質共同參與的主動程序化過程。炎癥消退過程起始于炎癥組織中細胞組分的轉變(促炎的M1巨噬細胞被抗炎的M2巨噬細胞所替代)以及炎癥信號的轉換，在SPMs合成之后，促炎介質的表達下調，抗炎細胞因子與SPMs抵御外來刺激，從而達到抗炎及促進炎癥消退的目的[35]。

AA、EPA(Eicosapentenoic acid)和DHA(Docosahexenoic acid)可經哺乳動物細胞中LOXs的協同催化生成SPMs。常見的SPMs包括脂氧素(Lipoxins，LXs)、消退素(Resolvins，Rvs)、Maresins(MaR1與MaR2)和保護素(Protectins)，以及CO等氣體。這些SPMs與免疫細胞表面G蛋白偶聯受體(GPCR32、ALX、BLT1)相結合發生特異性反應，能限制PMN募集、降低炎性因子的表達、誘導粒細胞凋亡、恢復血管通透性、增強巨噬細胞的吞噬作用以及清除組織細胞碎片，從而促進炎癥的消退，使機體恢復穩態[36]。

LXs大多衍生于AA，其能通過調節NF-кB等轉錄因子水平、抑制炎性細胞因子和趨化因子的產生、促進單核/巨噬細胞發揮非炎性吞噬作用而發揮抗炎及促炎消退的作用，被稱為炎癥過程的“剎車信號”[37,38]。LXs主要能通過3條跨細胞途徑，由多種LOXs順序催化AA生成[39]：(1)由血管中的5-LOX和12-LOX催化合成；(2)由單核巨噬細胞、氣道上皮細胞和血管內皮細胞內的15-LOX與5-LOX催化合成；(3)經由阿司匹林(Acetylsalicylic acid,ASA)誘發的乙酰化環氧合酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)和5-LOX催化合成，生成15-立體異構體LXs(15-epi-LXA4與15-epi-LXB4)，即ATL。

PD1、MaR1以及Rv能通過5-LOX、12/15-LOX催化DHA或EPA合成。E系Rv能改善炎癥疾病的臨床癥狀，它們的合成底物為EPA，首先經由中性粒細胞、上皮細胞中的ASA-COX-2催化，隨后經中性粒細胞中的5-LOX氧化生成RvE1或RvE2，或是被12/15-LOX催化合成RvE3。DHA能被中性粒細胞和上皮細胞中的15-LOX催化，并可進一步被中性粒細胞5-LOX作用而分別轉化為四種D系Rv，即RvD1、RvD2、RvD3和RvD4。Rvs在炎癥消退過程中能抑制粒細胞浸潤、促進對病灶中凋亡粒細胞的吞噬與組織再生從而達到炎癥消退的目的[40]。保護素能降低PMN的遷移、增強巨噬細胞對凋亡PMN的吞噬作用。DHA能被15-LOX催化生成PD1，或是在巨噬細胞中被12-LOX轉化為13S14S-epoxy-maresin，然后被水解酶水解成MaR1，MaR1能有效刺激細胞的胞葬作用和再生功能[41]。

SPMs不僅對非特異性免疫反應有重要調控作用，其還能調節特異性免疫反應[42]。RvD1、RvD2和MaR1可以降低Th1與Th17細胞中TNF-α與IFN-γ的表達[43]，LXA4能通過FPR2/ALX減少記憶B細胞抗體的產生[44]，它們還能通過調節T淋巴細胞、B淋巴細胞協同巨噬細胞、粒細胞來控制炎癥的發生，縮短炎癥消退過程的時間，促進機體恢復并減輕傷痛。SPMs作為機體內源性的促炎消退脂類介質，對機體生理功能無影響，且安全、無毒副作用，有望開發成為臨床抗炎鎮痛的新藥。

4 結語

炎癥與大多疾病的發生發展息息相關，對促炎消退過程的正確認識為我們提供了對抗疾病、恢復機體穩態的一個新思路。5-LOX和12/15-LOX不僅在促炎與抗炎反應中扮演著重要角色，更是合成促炎消退脂質介質的關鍵酶。因此，全面解讀LOX的雙重作用可為相關疾病指明更準確的治療方向。

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[收稿2017-03-14 修回2017-04-07]

(編輯 許四平 劉格格)

①本文為四川農業大學學科建設雙支計劃(3572070)和國家自然科學基金項目(31660371)。

②寧夏大學農學院，銀川 750021。

R364.5

A

1000-484X(2017)10-1598-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.034

黃逸馨(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事動物臨床分子診斷與治療的研究，E-mail：huangyx213@163.com。

及指導教師：曹隨忠(1971年-)，男，博士，教授，主要從事動物臨床分子診斷與治療的研究，E-mail：suizhongcao@126.com。