瓜氨酸化及相關抗體在類風濕關節炎中作用的研究進展

任婷婷，李鴻斌

·新進展·

瓜氨酸化及相關抗體在類風濕關節炎中作用的研究進展

任婷婷，李鴻斌*

類風濕關節炎(RA)是以關節受累為主的全身性自身免疫疾病，有研究指出瓜氨酸化可能是其發病起點。但瓜氨酸化是人體內普遍存在的轉錄后修飾過程，并非RA的專利。而針對瓜氨酸肽產生的抗瓜氨酸肽抗體(ACPAs)對RA具有高度特異性。本文就瓜氨酸化及ACPAs在RA中的作用進行綜述，以期了解其在RA發生發展過程中的意義。

關節炎,類風濕；瓜氨酸化；抗瓜氨酸肽抗體

任婷婷，李鴻斌.瓜氨酸化及相關抗體在類風濕關節炎中作用的研究進展[J].中國全科醫學，2017，20(13)：1654-1658.[www.chinagp.net]

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類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、進展性，以關節受累為主的全身性自身免疫疾病，我國RA的患病率為0.32%～0.38%[1]。瓜氨酸化(citrullination)是人體內普遍存在的轉錄后修飾過程，并非RA專利。但針對瓜氨酸肽的自身抗體——抗瓜氨酸肽抗體(anti-citrullinated peptide antibodies,ACPAs)對RA具有高度特性，其可在關節癥狀出現前多年檢出[2]。2010年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯盟將其中的抗環瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide,CCP)抗體列入RA的分類診斷標準[3]。RA中為什么會出現異常的瓜氨酸化蛋白/肽，抗CCP抗體除了診斷價值外，在疾病的發生發展中是否也起到了一定的作用，本文就此進行綜述，以期了解其在RA發生發展過程中的意義。

1 瓜氨酸化和肽酰基精氨酸脫亞胺酶

瓜氨酸化是指肽酰基或游離氨基酸在酶的催化下脫掉一個亞胺基，轉化為瓜氨酸的過程，是人體內普遍存在的轉錄后修飾過程[4]。可見于凋亡、細胞終末分化、基因調控、生殖發育等生理過程[5]；也可見于類風濕關節炎、炎性關節病、多發性肌炎、炎性腸病、慢性扁桃體炎、多發性硬化及1型糖尿病等病理狀態[6]。人體內的瓜氨酸化受到肽酰基精氨酸脫亞胺酶(peptidylarginine deiminase，PAD)的催化。目前人體內共發現5種PAD(即PAD1、2、3、4、6)，其中PAD2及PAD4在RA研究中最為廣泛。人體PAD的活性依賴于高Ca2+水平，只有Ca2+水平達10-5mol/L時才可發揮酶活作用[7]，在高Ca2+水平下，PAD中的半胱氨酸殘基結合到精氨酸的胍基上，脫去一分子氨，形成四面內旋的過渡狀態，后利用水分子的親核性恢復半胱氨酸殘基并形成一個酮基，從而使精氨酸轉化為瓜氨酸[8]，轉變的過程中蛋白展開，失去了陽性電荷，同時分子內和分子間的相互作用消失，最終被蛋白酶降解。

2 瓜氨酸化的影響因素

2.1 遺傳與環境因素 RA具有一定的遺傳易感性，全基因組研究(genome-wide association studies，GWASs)目前已發現100多個相關遺傳易感位點，其中針對人白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的研究最多[9]。RA患者多攜帶HLA-DRB1*0401/*0404等位基因，其β鏈N末端的70～74位存在一段共同序列(gly-lys/arg-ala-ala，QQRAA/QKRAA/KKRAA)，稱為RA共同表位(SE)，是HLA-DRB1抗原結合槽的主要構成序列[10]。HILL等[11]在研究T細胞在RA中的作用時發現，經瓜氨酸化的波形蛋白與SE的親和力較未修飾的蛋白高100倍，后FEITSMA等[12]發現經瓜氨酸化的纖維蛋白原也有相似的表現。瓜氨酸化蛋白/肽與HLA-DRB1 SE是關節炎發生的兩個必要條件[13]。PRATESI等[14]發現，ACPAs的滴度與SE呈劑量依賴關系，擁有2個SE的RA患者其ACPAs產生的數量要明顯高于1個或沒有SE的患者。針對RA的發病機制，有學者提出“二次打擊”學說[15]，即經過第1次打擊健康個體轉變為ACPAs陽性個體，這時產生的ACPAs滴度較低，只能識別個別表位，對瓜氨酸化的抗原的親和力較低，不足以激發局部的免疫聚集反應。這似乎可以解釋為什么ACPAs可在RA發病前10年檢出，而沒有任何關節癥狀。經過第2次打擊后ACPAs出現同型擴張、數量增加及表位擴展現象，導致ACPAs陽性個體轉變為ACPAs陽性的RA患者。既往認為HLA在整個過程中起到了重要作用，尤其是第1階段的ACPAs的產生，但近來研究指出HLA并非增加了ACPAs的陽性率，而是增加了由ACPAs陽性轉變為ACPAs陽性RA的風險[16]，也可以說HLA并非參與ACPAs的形成，而是促進了其成熟[17]。

2.2 環境因素

2.2.1 吸煙 RA與吸煙的關系于1987年提出，VESSEY等[18]在研究口服避孕藥與RA的關系時意外發現每天吸煙>15支的女性患者的住院率為非吸煙者的2.5倍。瑞典一項關于RA的流行病學調查發現，曾經吸煙且攜帶SE的健康人易發展為RA[19]。而吸煙與SE之間的相互作用，在ACPAs陽性人群中更加明顯[20-21]。有研究指出健康吸煙者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)中瓜氨酸化蛋白的檢出率較不吸煙對照組明顯增高，且其增加的程度與PAD水平呈正相關[22]，這說明吸煙可能通過增加局部PAD來促進局部瓜氨酸化。煙草中的有害物質也會導致組織破壞，如硫氰酸鹽可在髓過氧化物酶(MPO)的作用下產生高瓜氨酸化蛋白(homocitrullinated protein)，這種高瓜氨酸化蛋白與瓜氨酸蛋白同源，其區別僅在于高瓜氨酸化蛋白側鏈中多一個碳原子，故有假說認為機體可能通過模糊識別等方式對吸煙導致的高瓜氨酸化蛋白產生反應，導致ACPAs的產生RA的發展[23]。有研究小組隨即指出使用高瓜氨酸化蛋白去免疫DR4-IE轉基因小鼠，并未發現小鼠體內出現RA特異性ACPAs[23]。但這不足以推翻以上假說，目前檢測手段有限，并非可以檢測到所有針對瓜氨酸化的抗體，故并不能排除高瓜氨酸化的致RA作用。

2.2.2 牙齦卟啉單胞菌感染 牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis，Pg)是與RA密切相關的另一個環境因素，其是牙周疾病(periodontitis，PD)的主要病原體，是除人等脊椎動物外，唯一含有活性PAD的原核生物[24]。與人PAD作用方式有所不同，Pg的PAD活性不依賴高水平Ca2+，其主要作用于精氨酸的C末端，并可轉化游離的精氨酸[25]。

RA患者的PD發生率為3.95%，較正常人群的1%明顯增高[26]。KINLOCH等[27]對RA與Pg感染的遺傳相關性進行了研究，該研究小組以DR4-IE轉基因小鼠為實驗組，以MHC-Ⅱ敲除小鼠為對照組，分別使用人和Pg來源的瓜氨酸化烯醇化酶-1(citrullinated enolase peptide-1，CEP-1)免疫兩種小鼠，發現兩者均會使DR4-IE轉基因小鼠產生抗CEP-1抗體。這似乎也說明，人與Pg來源的瓜氨酸化CEP-1存在一定的相似性。后REED等[28]指出，RA患者中針對CEP-1的自身抗體同樣會與Pg來源的CEP-1結合，也支持這一觀點。有研究小組做了更細致的分析，發現人源性CEP-1與Pg源性CEP-1有82%的相似度，其中有9個氨基酸是完全一致的[29]。Pg中的PAD不僅可以催化自身組織，同樣可以催化人體蛋白。除此之外，PAD在催化人的纖維蛋白原和α-烯醇化酶的同時也可激活中性粒細胞中的蛋白激酶受體-2(protease-activated receptor，PAR-2)，從而升高細胞內Ca2+水平，進而活化人的PAD，造成反應的進一步擴大[30]。故Pg可通過多種機制誘導蛋白瓜氨酸化，促使自身抗體的產生。

2.3 細胞水平異常 環境因素作用于遺傳易感者會導致局部內環境改變，細胞裂解死亡，造成Ca2+水平增高，原本處于胞內的蛋白暴露于胞外，溢出的蛋白受到激活的PAD的催化，暴露瓜氨酸表位，導致多種ACPAs產生，通過抗體的免疫介導作用使反應進一步擴大，造成組織不可逆損傷。目前認為有3種機制可能造成RA組織細胞損傷暴露抗原表位，即凋亡、自嗜及中性粒細胞胞外誘捕(neutrophil extracellular traps,NETs)[31]。

凋亡是指細胞的程序性死亡。在細胞凋亡過程中，細胞外的Ca2+不斷進入細胞激活PAD，導致周圍組織瓜氨酸化，經瓜氨酸化的蛋白其中間絲蛋白聚合能力和纖維形成能力的完全喪失，使蛋白易于降解。蛋白一旦被瓜氨酸化修飾很快被吞噬細胞吞噬，阻止了進一步的炎性反應[32]。凋亡過程的異常調節和/或凋亡片段無效清除可能會暴露核抗原，從而打破免疫耐受，形成針對瓜氨酸化的自身抗體。

自嗜是真核細胞中高度保守的信號通路，可以出現在細胞內大分子和細胞器通過溶酶體系統降解的生理過程；也可以出現在細胞衰老或生長因子缺乏的條件下，細胞以自殘的方式死亡的病理過程[31]。IRELAND等[33]最早提出自嗜可能參與到抗原提呈細胞(antigen-present-ing cells，APCs)提呈瓜氨酸化肽的過程中。最近的研究證實了該觀點，樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)和巨噬細胞及B淋巴細胞均會出現自嗜現象，只有通過自嗜這些抗原提呈細胞才可呈遞瓜氨酸化的抗原。自嗜抑制劑3-甲基腺嘌呤在抑制自嗜的同時也抑制了瓜氨酸肽的提呈，這反過來也證實了自嗜與瓜氨酸抗原提呈的相互關系[34]。

中性粒細胞可通過吞噬、氧化破裂和釋放溶酶體酶等多種方式起到抗感作用。SOHN等[35]發現中性粒細胞來源的組蛋白是ACPAs的主要攻擊目標，有90%以上的RA患者會出現針對瓜氨酸化的H2B型組蛋白的抗體。最近研究發現中性粒細胞可表現出NETs現象，其是自身抗原客觀化的一個過程。細菌、脂多糖(LPS)、真菌及活化的血小板可刺激NETs的產生。NETs結構內富含抗微生物分子，具有捕殺病原體的作用，同時也可致組織損傷[35]。NETs可見于多種自身免疫疾病，如血管炎、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、痛風、RA等[36]。NETs可以形成一種新的細胞死亡形式叫做NETosis，在這個過程中，局部NADPH誘導活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，彈性蛋白酶(NE)和MPO從多型核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)胞內顆粒轉運至核內，核膜破裂染色體釋放。KHANDPUR等[37]發現，RA患者的血清、免疫球蛋白片段及高滴度ACPAs可顯著增強NETosis。事實上，在NETosis的過程中，中性粒細胞會通過外化瓜氨酸化的自身抗原參與到RA發病機制中，而且ACPAs也會誘導NETs的形成。白介素17A(IL-17A) 及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細胞因子也會誘導RA中NETosis的發生，反過來NETs也可通過誘導白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、趨化因子和黏附分子來擴大RA滑膜的炎性反應。也就是說NETosis可以通過外化瓜氨酸化的抗原及免疫刺激分子來推動關節及其周圍異常的適應性和先天免疫反應[37]。

3 ACPAs

3.1 ACPAs的發現 ACPAs是RA的特異性抗體，可在關節癥狀出現前10年檢出。1964年荷蘭學者NIENHUIS等[38]使用頰黏膜細胞作為底物，采用間接免疫熒光法檢測抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)時發現細胞核周圍的胞質內有均質形球狀熒光顆粒，稱其為抗核周因子(antiperinuclear factor，APF)。15年以后MALLYA等[39]以鼠食道的冰凍切片為抗原使用免疫熒光法在RA患者的血清及關節液中，檢測出抗角蛋白抗體(AKA)。多年后發現，APF及AKA識別的是相同抗原：瓜氨酸化的聚絲蛋白(filaggrin)，及后續發現的Sa抗體、抗聚絲蛋白抗體(AFA)及抗CCP抗體均是針對瓜氨酸蛋白/肽的自身抗體[40]。

3.2 ACPAs的產生機制及T淋巴細胞在其中的作用 目前認為有3種機制可以產生ACPAs：(1)交叉免疫，機體感染某些微生物后，病原體中的PAD酶會催化局部蛋白瓜氨酸化，隨后機體會針對這些病原體及其瓜氨酸化產物產生免疫反應，激活了微生物特異性T淋巴細胞，T淋巴細胞輔助B淋巴細胞產生針對瓜氨酸肽的抗體，而這些抗體不僅會針對病原體中的瓜氨酸化，還可識別機體自身的瓜氨酸肽，造成組織損傷。(2)分子模擬，微生物中PAD催化形成的瓜氨酸肽與人體的瓜氨酸肽就有高度相似性，從而激活了自身反應性T淋巴細胞，通過針對瓜氨酸化的B淋巴細胞，產生自身抗體。(3)產生新的抗原，吸煙、感染含有PADI的細菌、PADI位點的多態性及機體針對PADI產生的抗體均會增加機體的瓜氨酸肽，這些新形成的瓜氨酸肽被機體視為異物，通過HLA-SE的提呈，活化了CD4+T淋巴細胞及產ACPAs的B淋巴細胞[41]。

CD4+T淋巴細胞在RA的發病過程中起到了重要作用，其在抗原的刺激下可分化為不同的效應T細胞，其中最為重要的是輔助性T細胞17(Th17)和調節性T細胞(Treg)。Th17為前炎性細胞，可加速自身免疫反應及組織破壞；而Treg具有拮抗作用，其在免疫耐受和調節對腫瘤、感染等過度免疫反應中起到了重要作用。研究發現RA患者的滑液中Th17明顯聚集，其釋放白介素17(IL-17)，進而活化巨噬細胞、DCs及成纖維細胞樣滑膜細胞，同時可促進TNF-α、IL-6、白介素1β(IL-1β)及基質金屬蛋白酶(matrix metaloproteinases，MMP)的產生加速對軟骨和骨的破壞[42-43]。本課題小組前期研究發現RA組Treg明顯低于正常對照組，但CCP表達陽性組與陰性組間并無差異，但Th17/Treg比值在CCP陽性表達組明顯高于陰性組，可能提示CCP介導的免疫應答以活化Th17為主[44]。

4 ACPAs的致病作用

4.1 ACPAs致病的分子機制 ACPAs作為一種抗體其可以通過活化補體及Fc受體陽性的細胞來起到免疫募集效應。有3種激活補體的途徑，大部分免疫球蛋白與相應的抗原結合后主要激活經典途徑，而ACPAs不僅可以激活經典途徑，也可激活旁路途徑。除了激活補體外，ACPAs也可通過Fc受體來激發免疫反應，通過這種方式，ACPAs和激活多種細胞產生相應效應：ACPAs與瓜氨酸化的纖維蛋白原組成的免疫復合物，可通過巨噬細胞上的FcγR來促進TNF-α的分泌；IgE型ACPAs可通過與免疫球蛋白ε受體β型亞單位(FcεRI)的細胞連接，激活嗜堿粒細胞；且IgE型ACPAs陽性的患者，其脫顆粒巨細胞的水平也明顯增高。由此可以看出ACPAs是致病因素而非局部滑膜炎的結果[40]。

4.2 ACPAs在關節表現中的作用 ACPAs可在RA患者的血清及關節滑液中檢出，其在滑液中的水平要明顯高于血清。ACPAs在滑膜局部聚集是RA關節破壞的重要原因之一。RA患者關節局部TNF-α、白介素1(IL-1)、IL-6水平明顯增加，在這些細胞因子的作用下局部核因子κ-B受體活化因劑(receptor activator of nuclear factor κ-B ligand,RANKL)增多[45]，RANKL是調整骨代謝的關鍵分子，是骨破壞的一個標志，其可刺激破骨細胞的生成。有研究指出，ACPAs陽性的RA患者血清RANKL水平高于陰性者，且骨侵蝕的面積與ACPAs及類風濕因子(rheumatoid factor，RF)的滴度相關，ACPAs陽性的RA患者骨體積、骨密度、骨皮質厚度均較健康對照組和骨關節炎組低[45]。一方面，ACPAs可能通過RANKL加速骨破壞；另一方面，破骨細胞可以表達高水平的PAD，其表面可形成多種瓜氨酸化蛋白，ACPAs通過與破骨細胞表面的瓜氨酸化抗原相互作用，來發揮作用；另外除了破骨細胞外，成骨細胞功能不全也是起到了一定的作用，滑膜內成纖維細胞會增加Dkk-1的表達從而抑制成骨細胞的分化，局部產生的硬化蛋白(sclerostin)也會抑制成骨細胞的活性[45]。

5 小結

抗CCP抗體作為類風濕關節炎的特異性抗體，不僅具有診斷價值，且在疾病的發生發展過程中也起到了重要的作用，ACPAs是針對瓜氨酸肽抗原產生的，那么封閉相關抗原是否可以起到抑制疾病發生發展的作用呢？本課題組擬通過生物技術手段連接P53與anti-CCP-ScFv，通過原核表達體系構建抗CCP四價小分子抗體，并進行可溶性表達與鑒定，為后續在體試驗奠定基礎。

作者貢獻：李鴻斌進行文章的構思與設計；任婷婷進行文章的可行性分析、文獻/資料收集與整理、撰寫論文、中英文修訂，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔沙沙)

Research Progress of the Role of Citrullination and Related Antibody in Rheumatoid Arthritis

RENTing-ting,LIHong-bin*

DepartmentofRheumatology,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010000,China

*Correspondingauthor:LIHong-bin,Professor,Mastersupervisor;E-mail:lhb73@126.com

Rheumatoid arthritis(RA) is a systemic autoimmune disease that characterized by joint affection.Studies have suggested that citrullination may be the onset of the attack of RA.However,citrullination is the ubiquitous posttranscriptional modification process in the human body,not the necessary causes of RA.While anti-citrullinated peptide antibodies(ACPAs) produced against citrullinated peptides are highly specific for RA.The paper reviews the effect of citrullination and ACPAs on RA,and hopes to understand the significance of them in the occurrence and development of RA.

Arthritis,rheumatoid;Citrullination;Anti-citrullinated peptide antibodies

R 593.22

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.13.024

2016-10-15；

2017-01-23)

010000內蒙古呼和浩特市，內蒙古醫科大學附屬醫院風濕免疫科

*通信作者：李鴻斌，教授，碩士生導師；

E-mail：lhb73@126.com