副豬嗜血桿菌病實驗室診斷方法綜述

魏 鳳，張文通，李 峰，沈志強,

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

副豬嗜血桿菌病實驗室診斷方法綜述

魏 鳳1，張文通2，李 峰1，沈志強1,2

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

副豬嗜血桿菌病是引起呼吸系統疾病的重要傳染病之一，嚴重危害養豬業健康發展。正確診斷副豬嗜血桿菌病對防治該病極為關鍵。本文就該病病原分離鑒定、血清學診斷、分子生物學診斷三方面展開闡述，以期弄清該病診斷方面的研究進展。

副豬嗜血桿菌；診斷方法；綜述

副豬嗜血桿菌病（HPS）是豬的一種傳染性病癥，以呼吸困難、多發性漿膜炎和關節炎為主要特征。該病主要影響2周齡到4月齡的青年豬。感染豬群主要在斷奶前后和保育階段發病，通常見于5～8周齡的豬，發病率達20%～30%，嚴重時死亡率可達50%以上。該病隨著養豬集約化發展，再加上免疫抑制病（如豬圓環病毒2型病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征等），目前在我國流行日趨嚴重[1-3]。預防該病所用的疫苗由于血清型之間的差異，交叉保護率低，給養豬業帶來嚴重的損失，已成為影響養豬業最重要細菌性疾病之一。

防治該病的關鍵措施之一是對該病病原的確診。依靠對發病豬群的病史、臨床癥狀、剖檢病變這些傳統診斷方法可以進行初步診斷，但弄清病原乃至病原的血清型必須依靠實驗室診斷。自1922年Schermer和Ehrlich分離出該病原以來，科研工作者對該病確診進行了大量的研究，取得了顯著成績。本文就該病實驗室診斷方法的研究進展進行了如下綜述。

1 細菌分離鑒定

細菌的分離培養對確診是十分有必要的，但往往因雜菌的干擾而不能分離成功。

細菌分離鑒定時應當采集處于疾病急性期的豬并且沒有使用抗生素的病料，無菌操作條件下采集病豬肺臟、關節液、淋巴結等組織，通常在接種于含NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的巧克力瓊脂平板。在含血清和NAD的TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂）培養基培養48 h后，可以觀察到針尖大小、圓形、光滑濕潤、無色透明、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色后顯微鏡下觀察，為革蘭氏陰性細小桿菌。在無菌操作條件下，挑取上述可疑菌落，水平劃線接種于無 NAD 的綿羊鮮血平皿上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37 ℃培養 24～48 h后，觀察其在葡萄球菌周圍生長情況，應出現“衛星生長現象”且無溶血現象[3-4]。

2 血清學診斷

副豬嗜血桿菌病血清學的診斷方法主要包括補體結合試驗(CF)，平板凝集試驗、間接血凝試驗(IHA)及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。

補體結合試驗，用補體結合試驗方法檢測副豬嗜血桿菌的抗體，發現在補體結合試驗中各種血清型之間具有廣泛的交叉反應性。

高艷等利用副豬嗜血桿菌陜西分離株制備平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制備血清抗體，建立副豬嗜血桿菌平板凝集檢測方法。采用本試驗建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法對臨床血清樣品的檢測結果與臨床診斷結果基本一致。

魏子貢等用超聲波破碎的副豬嗜血桿菌血清4型和血清5型抗原代替副豬嗜血桿菌煮沸物或熱酚水透析物，用醛化鞣酸化的綿羊紅細胞代替新鮮綿羊紅細胞，經對免疫豬群的抗體水平檢測，免疫豬群2周后抗體檢出率達89%；對1 665份豬血清進行檢測，陽性率為47.1%。該方法敏感性較高，特異性強、重復性好，可用于疫苗免疫后抗體水平的檢測及副豬嗜血桿菌的流行病學調查。石碧等建立了用莢膜多糖作為包被抗原的間接血凝方法，通過優化莢膜最佳生長條件，得到了高質量的抗原，從而使抗體檢測的敏感性得到了大大的提高。而Miniats等曾用副豬嗜血桿菌0322株鹽水浸出抗原致敏綿羊紅細胞檢測陽性血清，結果表明IHA法與間接ELISA檢測法符合率為65.3%。

李鵬等利用純化融合P2蛋白作包被抗原及優化ELISA反應條件，建立了可檢測抗HPS P2蛋白抗體的間接ELISA方法，并用所建立的P2-ELISA與國外進口的HPS檢測試劑盒Synbiocits-ELISA對196份臨床送檢血清進行平行檢測，陽性符合率為93.4%。臧瑩安等利用副豬嗜血桿菌OMP P5基因表達并純化復性后蛋白作為包被蛋白，建立針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5的間接ELISA抗體檢測方法， 通過對進行和未進行 HPS免疫的健康豬血清的檢測，證實了建立的間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強、反應快速準確等特點，可用于HPS的快速診斷。鄭念廣等采用121 ℃高壓處理副豬嗜血桿菌4型和5型耐熱蛋白，混合作為包被抗原，建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法。結果表明敏感性比間接血凝試驗高與國外ELISA試劑盒一致，可用于副豬嗜血桿菌的血清抗體檢測和血清流行病學調查。馮小明等采用超聲裂解的副豬嗜血桿菌菌體上清作為包被抗原,建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法。建立的間接ELISA方法的特異性和重復性良好,敏感性比間接血凝試驗高,可用于副豬嗜血桿菌的檢疫和流行病學調查 。

3 分子生物學檢測

在動物傳染性疾病的診斷研究中，分子生物學方法的引入，大大提高了診斷結果的準確性，特別是對一些生長緩慢的病原體所致的疾病的診斷的發展。

根據副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設計的引物建立的PCR診斷方法可以從臨床樣品中檢測出副豬嗜血桿菌，這種方法檢測的最小細菌濃度為102CFU/mL，其敏感性也遠遠高于常規的細菌分離方法。劉建奎等針對副豬嗜血桿菌16 S rRNA序列設計1對特異性引物，并據此建立了快速準確鑒定副豬嗜血桿菌PCR方法，13份疑似病料檢測結果表明，PCR檢測結果與傳統生化鑒定結果符合率為100%。

車勇良等建立一種可快速檢測副豬嗜血桿菌的環介導等溫擴增（LAMP）方法。是常規PCR檢測最低限的100倍，顯示出較高的敏感性。

2013年，李富祥等根據副豬嗜血桿菌16 S rRNA基因的保守序列設計特異性引物和TaqMan探針，建立了副豬嗜血桿菌TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。結果表明，該方法最低可檢測到6.92×101copies/μL的標準品陽性質粒；臨床樣品檢測結果表明，該方法可用于副豬嗜血桿菌感染的早期診斷和流行病學調查以及副豬嗜血桿菌的定量分析。羅寶正等參考 GenBank 已發表的副豬嗜血桿菌轉錄起始因子infB基因序列設計特異性引物和探針，建立基于TaqMan探針熒光PCR技術檢測副豬嗜血桿菌的方法。結果表明 TaqMan 探針熒光 PCR 方法和細菌分離方法的檢測效果一致。

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2017-03-17）

山東省現代農業產業技術體系生豬創新團隊項目 SDAIT-08-17

魏鳳，女（1979-），河南遂平人，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究，E-mail：hzndzwt1@163.com