大鼠脊髓損傷后ski相關蛋白表達的時空變化規律及作用

朱彥東，周開升，郭永強，江龍，鄭利強，汪靜，李森，龍在云，伍亞民，張海鴻

大鼠脊髓損傷后ski相關蛋白表達的時空變化規律及作用

朱彥東1,2，周開升1,2，郭永強1,2，江龍1,2，鄭利強1,2，汪靜2，李森3，龍在云3，伍亞民3，張海鴻1

目的探究大鼠脊髓損傷后ski相關蛋白(SKIP)的表達及其變化規律。方法60只成年雌性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(n=30)和打擊組(n=30)，每組分為1 d、3 d、5 d、7 d、14 d五個時間點，各6只。打擊組用Allen法制作T10打擊損傷模型，假手術組只咬開椎板。采用BBB評分評價后肢運動功能；尼氏染色觀察損傷后脊髓神經元的病理變化；免疫熒光染色觀察損傷脊髓SKIP的表達情況。結果打擊組各時間點BBB評分均顯著低于假手術組(t＞48.267,P＜0.001)。與假手術組相比，打擊組5 d脊髓神經元胞漿中尼氏小體開始崩解、凝聚，分布不規則，神經元變性壞死，14 d時損傷加重。免疫熒光染色顯示，SKIP主要在脊髓灰質中表達，白質中極少表達；損傷后SKIP表達逐漸上升，5 d時達到高峰(t=-17.035,P＜0.001)，14 d時明顯降低(t=3.853, P＜0.05)。結論SKIP可能是一種作用于神經元并影響其凋亡的新的信號分子。

脊髓損傷；ski相關蛋白；神經元；凋亡；大鼠

[本文著錄格式]朱彥東，周開升，郭永強，等.大鼠脊髓損傷后ski相關蛋白表達的時空變化規律及作用[J].中國康復理論與實踐,2017,23(8):912-918.

CITED AS:Zhu YD,Zhou KS,Guo YQ,et al.Temporal and spatial variation of ski-interacting protein expression in rats after spinal cord injury and its role[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(8):912-918.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)多源于創傷性損害，例如車禍、物理性打擊、高處墜落以及運動性損害等[1]。隨著社會快速發展，脊髓損傷發病率呈逐年上升趨勢。脊髓損傷后癥狀復雜、截癱發生率高、病理變化多變，能夠改善愈后的治療措施非常有限，脊髓損傷如今已成為亟待攻克的醫學界難題之一。

ski相關蛋白(ski-interacting protein,SKIP)是一種細胞核激素受體共活化物，可與原癌基因ski結合來調節細胞的增殖與分化。此外，作為一種特殊的轉錄輔助因子，SKIP涉及多種信號傳導通路的調控過程[2-3]，比如病毒性原癌基因v-ski、轉化生長因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)、特異性Smad蛋白，這些信號傳導通路在中樞神經系統中起著廣泛的作用，參與脊髓損傷后的一系列病理生理變化。此外，最近的一些研究發現，腦損傷后SKIP在大腦皮層中的表達量顯著升高；視神經損傷后，視網膜神經節細胞內SKIP的表達量也明顯升高；外周神經損傷后SKIP的表達量也有一定升高[4-6]。

本研究旨在初步探究大鼠脊髓損傷后SKIP的表達及其變化規律，為進一步探究其在脊髓損傷后的作用及其作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

60只成年雌性Sprague-Dawley大鼠，SPF級，體質量180～220 g，由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供。實驗開始前1周，將大鼠飼養于動物實驗室，保持室溫25～28℃，給予自然晝夜采光，自由進食、水，定期更換墊料。動物的飼養及實驗過程均遵守實驗動物管理及保護規定。將60只大鼠編號，按隨機數字法分為假手術組和打擊組，各30只。

1.2 主要儀器與試劑

RM2007型Allen打擊器：美國新澤西州大學。CM1900冰凍切片機、SP-2激光共聚焦顯微鏡：LEICA公司。尼氏(Nissl)染液試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司。SKIP抗體、NeuN抗體、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體：美國MILLIPORE公司。Alexa Fluor?488標記山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor?488標記山羊抗雞IgG(H+ L)：北京中杉金橋。iFluor 647標記山羊抗小鼠IgG (H+L)、iFluor 647標記山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天。

1.3 動物模型

1%戊巴比妥鈉40 mg/kg經腹腔注射麻醉大鼠，待其角膜反射消失后剃去手術區域皮毛，俯臥位固定于手術臺上，術區皮膚用碘伏消毒。定位T10，以T10為中心在背部正中切一長約2 cm的縱行切口，逐層分離筋膜、肌肉至露出椎板，咬開T9-11椎板，顯露脊髓(硬脊膜完整)。設定Allen打擊強度為10 g×25 mm，實驗大鼠打擊T10脊髓，打擊后大鼠雙側后肢及尾巴出現痙攣性抽搐，脊髓打擊部位充血腫脹則視為打擊成功。假手術組僅咬開椎板，顯露脊髓。打擊完成后逐層縫合傷口，給予青霉素1.6×105U肌肉注射，連續3 d；術后大鼠自由進食、水，飼養于室溫25～28℃的動物實驗室內，每日早、中、晚按摩、擠壓膀胱協助其排尿，直至自主排尿功能恢復。

1.4 評定方法

1.4.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分

于造模后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d，分別取6只大鼠進行1次BBB評分，以評估大鼠雙側后肢運動功能。評分方法：將大鼠放入曠場內，任其自由活動，觀察雙側后肢運動功能5 min，并按照相應標準進行評分。每只實驗大鼠的評分均由2名熟悉BBB評分法的非本組實驗人員完成。其中1 d及3 d時，若評分高于2分則視為造模失敗，剔除后重新造模補充。

1.4.2 尼氏染色

每一時間點評分完成后，兩組各取3只大鼠，成功麻醉后暴露心臟，0.01 mol/L PBS經左心室快速灌注，直至右心耳流出清亮液體，肝臟變白之后改用4%多聚甲醛快速灌注。固定30 min后取出脊髓組織，置于4%多聚甲醛中繼續固定24 h。在30%蔗糖PBS溶液中充分脫水后，以T10中心、上下各留3～4 mm，截取脊髓組織6～8 mm，使用O.C.T冰凍切片包埋劑包埋，從上至下連續切片(橫切)后行尼氏染色，觀察脊髓損傷后尼氏小體的病理變化。

1.4.3 免疫熒光單標染色

每個時間點各另取3只大鼠，按上述方法冰凍切片后行免疫熒光單標(SKIP)染色。0.01 mmol/L PBS沖洗5 min，共3次，0.3%Triton X-100配制10%山羊封閉血清溶液，并用此溶液破膜封閉60 min，甩干后不洗，添加相應SKIP抗體(1∶100)，置于4℃冰箱中過夜；次日取出，室溫下復溫，0.01 mmol/L PBS沖洗5min，共3次；在避光條件下添加山羊抗兔Alex fluor488(1∶200)，37℃烤箱中反應1 h，0.01 mmol/L PBS沖洗5 min，共3次，4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4' 6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核2 min，再次用0.01 mmol/L PBS沖洗5 min，共3次，甩干后甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4.4 平均光密度分析

選取距離損傷中心下端約2 mm、結構比較完整的組織切片，免疫熒光單標染色后用激光共聚焦顯微鏡在固定參數下掃描，選擇同一放大倍數的熒光照片，用Image J 1.4軟件分析計算得出陽性細胞面積(Area)及陽性細胞總光密度值(IntDen)，IntDen/Area得出平均光密度值后進行統計分析。

1.4.5 免疫熒光雙標染色

選取上述步驟切好的切片，行免疫熒光雙標染色，染色方法同1.4.3。一組切片所用一抗為SKIP(1∶100)+NeuN(1∶5000)，對應熒光二抗為山羊抗兔Alex fluor488(1∶200)+山羊抗小鼠iFluor647(1∶200)。另一組切片所用一抗為SKIP(1∶100)+GFAP(1∶1000)，對應熒光二抗為山羊抗雞Alex fluor488(1: 200)+山羊抗兔iFluor647(1∶200)。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 BBB評分

打擊組1 d、3 d組評分均為0～1分；之后后肢功能開始緩慢恢復，14 d時評分達到6分左右。打擊組各時間點評分均顯著低于假手術組(P＜0.001)。見表1。

2.2 尼氏染色

假手術組脊髓神經元胞漿中尼氏小體結構完整、清晰，單個存在且呈特征性分布；與假手術組相比，打擊組在打擊5 d時，尼氏小體開始崩解、凝聚、分布雜亂沒有規則；到14 d時凝聚加重。見圖1。

2.3 免疫熒光單標染色

假手術組SKIP微量表達，且主要分布于灰質神經元中，白質中幾乎無表達。與假手術組相比，打擊組1 d和3 d時，SKIP表達增強；5 d時，脊髓灰質中SKIP表達達到頂峰，熒光信號顯著增強；隨后開始下降，打擊14 d時，SKIP表達較5 d、7 d時明顯下降。見圖2。

2.4 光密度值

與假手術組比較，打擊1 d時SKIP輕微升高(P＜0.05)，打擊3～7 d時SKIP表達明顯增高(P＜0.01)，5 d時達到高峰，打擊14 d時SKIP表達低于假手術組(P＜0.05)。見表2。

2.5 免疫熒光雙標染色

為了進一步明確SKIP在脊髓中的表達位置，我們選擇假手術組以及與假手術組相比SKIP表達明顯增強的打擊組5 d，選取距離損傷中心約2 mm的脊髓組織切片行SKIP+Neun以及SKIP+GFAP免疫熒光雙標染色。

假手術組脊髓灰質中只有神經元的特異性標志物NeuN高度表達(紅光)，SKIP表達微弱(綠光)；而在打擊組5 d，SKIP和NeuN均高度表達，且有共表達信號。在脊髓白質中，無論是假手術組還是打擊組，SKIP均微弱表達(紅光)，僅有GFAP表達(綠光)，無二者共表達信號。見圖3。

3 討論

脊髓損傷后，各種損傷因素常常導致暫時性或者持久性、部分或者完全性感覺、運動功能障礙，并且伴隨著嚴重的神經功能紊亂癥狀[7-8]、自主神經反應障礙、抽搐、腦卒中、血管病變及心臟驟停等[9]。當前針對脊髓損傷的治療方法主要著眼于減輕疼痛和癱瘓，并非促進脊髓功能的康復。脊髓損傷臨床治療方法的局限性讓越來越多的研究者將其研究方向著眼于探尋脊髓損傷后的演變過程及其深層的病理生理變化機制，以求尋找出針對脊髓損傷病變過程中不利因素的治療措施。

研究發現，脊髓損傷后的病理變化分為早期改變和晚期改變。早期改變由創傷性因素導致脊髓正常結構破壞，包括軸突斷裂、病灶挫傷、血腫等。晚期改變與生化因素、新陳代謝變化以及細胞變性相關[10]。脊髓損傷之后的數小時到數天時間里，由原發創傷因素誘發一系列分子及細胞變化，例如神經細胞凋亡[11]、膠質增生、炎癥反應[12]，這些病理生理變化將會導致繼發性組織損傷、再生障礙以及神經功能缺陷。其中神經細胞大量凋亡，將會嚴重影響到神經傳導功能。

有研究指出，細胞周期重啟是神經元凋亡過程中的一個重要程序，并且神經元凋亡過程與細胞周期激活過程有相同的信號通路[13-14]。SKIP是一種新發現的多功能蛋白，作為一種剪接體元件和轉錄輔助因子，是多種重要的誘導基因不可或缺的轉錄激活物。有研究發現，SKIP在細胞周期重啟過程中起著非常重要的作用[15]，與多種腫瘤的發生發展及預后密切相關[16-18]。此外它也涉及到神經系統損傷的多種病理生理過程，例如，SKIP通過增強依賴TGF-β的轉錄途徑誘發損傷后炎癥反應的發生發展、腦外傷后誘導病理性神經元凋亡[4]，在外周神經沃勒變性過程中SKIP可以促進施萬細胞增殖[6]。

本研究結果發現，SKIP在正常脊髓中僅微量表達，但脊髓損傷后SKIP表達隨著時間推移逐漸增高，至損傷3 d時相比正常脊髓明顯增加，到損傷后5 d時達到頂峰，隨后開始降低，到損傷后14 d時僅微量表達。

尼氏小體與神經元的功能關系密切，其數量和形態變化可以間接反映神經元的病理生理變化[19]。通過對損傷中心下端脊髓組織進行尼氏染色后發現，損傷后5 d時，脊髓神經元胞漿中的尼氏小體開始崩解、凝聚、分布不規則，神經元變性壞死；至損傷后14 d時損傷加重，尼氏小體大部分凝聚，這就說明SKIP的表達變化先于尼氏小體的病理變化。

為了進一步明確SKIP在脊髓組織中的表達部位以及與神經元的關系，采用神經元的特異性標記抗體NeuN與SKIP進行免疫熒光雙標染色，同時使用膠質纖維特異性標記抗體GFAP與SKIP雙標作為對比，以SKIP表達顯著的損傷后第5天為例，結果表明，脊髓損傷后，SKIP主要在脊髓灰質神經元中表達，其熒光信號定位于脊髓灰質神經元中。

既往的研究表明，神經元凋亡與細胞周期重啟有高度相關性，二者具有相同的調控因素，例如視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)、E2F轉錄因子等[20-21]。Rb蛋白通過與轉錄輔助因子E2F家族相互作用在對細胞周期的調控中起著非常重要的作用[22]。有研究指出，一些急性或慢性神經變性疾病與細胞周期調節蛋白(如Rb和E2F1)的異常激活有密切關系[23-24]。另有研究發現，SKIP可以與原癌基因ski競爭結合Rb，并且解除Rb抑制轉錄的活性[25]，而Rb抑制轉錄的能力對于維持神經元的穩定十分重要。因此，根據我們現有的研究結果，推測SKIP可能通過抑制Rb的活性激活細胞周期，從而導致神經元凋亡；然而，這一猜想還需進一步實驗研究證實。

綜上所述，本研究初步明確SKIP在脊髓損傷后的表達及分布規律，并為進一步研究SKIP在脊髓損傷后的作用提供了理論依據。

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Temporal and Spatial Variation of ski-interacting Protein Expression in Rats after Spinal Cord Injury and its Role

ZHU Yan-dong1,2,ZHOU Kai-sheng1,2,GUO Yong-qiang1,2,JIANG Long1,2,ZHENG Li-qiang1,2,WANG Jing1,2,LI Sen3,LONG Zai-yun3,WU Ya-min3,ZHANG Hai-hong1
1.Department of Orthopedics,Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou,Gansu 730030, China;2.Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China;3.State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,the Third Department of Research Institute of Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China

ZHANG Hai-hong.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com

ObjectiveTo explore the expression and change of ski-interacting protein(SKIP)in rats after spinal cord injury.Methods A total of 60 adult female Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=30)and spinal cord injury(SCI)group(n=30), each group was further divided into five time points including one day,three days,five days,seven days,and 14 days with six rats in each time points.The model was established at T10with modified Allen's technique,and the sham group only bit the lamina of rats.The hindlimbs behavior was assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)score at each time point.The pathological changes of spinal cord neurons were detected with Nissl staining.The expression of SKIP were observed with immunofluorescence staining.Results The BBB scores were significantly lower in each time point in SCI group than in the sham group(t＞48.267,P＜0.001).Compared with the sham group,Nissl bodies in the cytoplasm of spinal cord neurons began to disintegrate,coalesce and irregularly distribute,the neurons began to degenerate and die on the fifth day,and the damage deteriorated on the 14th day.Immunofluorescence staining showed that SKIP expression was mainly expressed in the gray matter of the spinal cord and little expressed in the white matter.The expression of SKIP gradually increased after SCI,and reached a peak on the fifth day(t=-17.035,P＜0.001)and decreased significantly on the 14th day(t=3.853,P＜0.05).Conclusion SKIP may be a new signaling molecule,which play an important role in neuronal apoptosis after SCI.

spinal cord injury;ski-interacting protein;neuron;apoptosis;rats

R651.2

A

1006-9771(2017)08-0912-07

2017-03-06

2017-04-11)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.08.009

國家自然科學基金項目(No.30772299)。

1.蘭州大學第二醫院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，甘肅蘭州市730030；3.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所三室，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市400042。作者簡介：朱彥東(1989-)，男，漢族，甘肅天水市人，碩士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓損傷。通訊作者：張海鴻，主任醫師，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：脊柱外科。E-mail:zhanghaihong1968@sina.com。