蘇鐵葉抗氧化劑的制備

宋照風，趙海全

(佛山科學技術學院環境與化學工程學院化學工程系，廣東 佛山 528000)

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蘇鐵葉抗氧化劑的制備

宋照風，趙海全

(佛山科學技術學院環境與化學工程學院化學工程系，廣東 佛山 528000)

研究了以蘇鐵葉為原料超聲波提取蘇鐵葉抗氧化劑的工藝。以單因素實驗為基礎，進而進行正交實驗來達到優化提取工藝的目的。實驗得到最佳的提取條件為：浸提時間在10 h，液固比為14：1，超聲時間為1.5 h。用從蘇鐵葉中提取的抗氧化劑進行實驗可知：蘇鐵葉抗氧化劑能夠比等濃度的抗壞血酸更好的清除自由基，并且隨著蘇鐵葉抗氧化劑濃度的增加清除自由基的效果增強。

蘇鐵葉；超聲波提??；提取工藝；抗氧化劑；正交實驗

蘇鐵葉(Cycas revolute Thunb)又名鐵樹，常綠木本植物葉子，蘇鐵樹高1～4 m[1]。鐵樹，常用做景觀植物，不耐寒冷，在日常生活中也可用做入藥。蘇鐵葉含有的化學成分主要是蘇鐵雙黃酮(sotetsuflavone)，扁柏雙黃酮(hinokiflavone)，穗花杉雙黃酮(amentoflavone)，2,3-二氫扁柏雙黃酮(2,3-dihydrohinokiflavone)，2,3-二氫穗花杉雙黃酮(2,3-dihydroamentoflavone)等[2]。

鐵樹一般都會被認作是觀賞類植物[3]，但在中醫方面，鐵樹可是極具藥用價值的植物，蘇鐵葉在中醫層面被廣泛應用，但不單單是蘇鐵葉具有藥用價值，根、花和種子同樣具有優秀的藥用價值[4]。蘇鐵在西南地區廣泛種植，在缺少食物的情況下，蘇鐵也可用于入食充饑。中醫一般用蘇鐵葉來治愈出血、胃炎、胃潰瘍、高血壓、神經痛、閉經、癌癥等[5]。

蘇鐵樹是被成為植物中的活化石，同時也是世界上最古老的裸子植物，目前也是主要在兩廣地區生長[6-7]。蘇鐵樹的壽命很長，而且也是一年常青的。因此，在一年四季都能夠采摘到蘇鐵葉。

抗氧化劑是消除和淬滅氧自由基，延緩自由基的特殊的一種抵抗氧化連鎖反應的物質[8]。抗氧化劑是一種隔離氧氣不良影響的一種物質，它是通過捕捉并中和自由基，從而去除自由基對人體的傷害[9]?？寡趸瘎┌凑諄碓捶忠话惴譃樘烊豢寡趸瘎┖腿嗽炜寡趸瘎?，天然抗氧化劑一般都來源于植物類，動物類的抗氧化劑相對少。天然抗氧化劑在疾病的治療，化妝品，日用化學品和飼料中的運用較為廣泛[10]。

抗氧化劑按溶解性可分為油溶性、水溶性和兼容性三類[11]。油溶性包括人工合成的抗壞血酸酯類、丁羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等；水溶性包括抗壞血酸、異抗壞血酸及其鹽類、苯多酚等。目前食品工業主要使用人工合成抗氧化劑BHA和TBHQ[12]。

抗氧化劑通過還原反應來降低食品內部及周圍的氧含量，抗壞血酸和異抗壞血酸是非常好的抗氧化劑[13]，因為它們本身對氧非常敏感，它們能夠對非?？斓膶κ澄镏械难踹M行反應，從而降低氧對食物的破壞?？寡趸瘎┦峭ㄟ^釋放出自身的氫原子來和氧原子反應，從而阻止氧化，同時也能降低氧化酶的活性，使其不能催化氧化反應[14]。將能催化及引起氧化反應的物質封閉，如絡合能催化氧化反應的金屬離子等[15]。通過科學家的研究發現，法國冠心類疾病的低發生率的原因就是他們喜歡喝紅酒，因為在紅酒里有一種叫做原花色素的多酚類化合物[16-17]，這就是抗氧化劑的一種，可以幫助消除體內的氧原子及油脂。

由于提取抗氧化劑的原材料不同，抗氧化劑所存在的部位也不同，因此，就有多種不同的抗氧化劑提取方法。常用的有超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酸堿提取法、酶解法等[18]。

本文所使用的方法則是超聲輔助提取法。近年來越來越多植物有效成分的提取都會采用超聲波技術，因為其具有成本低、安全、操作簡單、無污染等一系列優點[19]。超聲波產生的長時間強烈振動能夠破壞細胞壁，去掉細胞壁的阻隔，從而讓溶劑能直接滲入細胞內進行有效浸提抗氧化劑，加速了抗氧化劑提取的進程，減短實驗所需要的時間，大大提高了抗氧化劑產率，是改善提取效果的一種新方法[20]。

1 實 驗

1.1 實驗材料和儀器

材料：蘇鐵葉，采集于學校荷花池邊；無水乙醇(分析純)、石油醚(分析純)、抗壞血酸(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)、過硫酸鉀(分析純)、ABTS(分析純)等，上海豐顯化學股份有限公司。

儀器：722型可見光分光光度計；TKD-1006A型單槽式超聲波清洗機；T500型電子天平；FA2004電子分析天平；D2KW-D-2型電熱恒溫水浴鍋；101-1A型電熱恒溫干燥箱等。

1.2 工藝流程

圖1 蘇鐵葉抗氧化劑的提取流程

1.3 實驗步驟

1.3.1 處理蘇鐵葉

將新鮮摘下的蘇鐵葉剪下，并且清洗干凈，將適量蘇鐵葉置于攪拌機中，開啟攪拌機，將蘇鐵葉打爛至粉碎，將所有蘇鐵葉粉碎之后，將其置于60 ℃的烘箱之后，待其恒重時，即可得到干燥的原材料。

1.3.2 浸提及超聲

取6.0 g干燥蘇鐵葉于燒杯中，加入16倍其質量數值的75%乙醇，浸提7 h。浸提結束之后，將燒杯置于50 ℃的超聲機中，超聲1 h，此過程中必須嚴格控制好溫度，避免溫度變化引起產品的純度。超聲結束后，將溶液倒入覆有濾紙的長頸漏斗中，靜置過濾，取其濾液進行下部操作(濾液背光為深紅色，透光為深綠色)。

1.3.3 除乙醇

將恒溫水浴鍋設置為75 ℃，將盛有濾液的燒杯置于恒溫水浴鍋中，并且將水浴鍋置于通風櫥下，這樣可加快乙醇的揮發速度，將溶液濃縮至快干時，結束水浴，將其置于通風櫥下晾干，結束除乙醇步驟。

1.3.4 萃取產物

往盛有干燥產物的燒杯中加入少量蒸餾水，攪拌使其成為懸濁液。量取20 mL石油醚對懸濁液進行萃取，去除萃取液，重復三次石油醚萃取。接著再量取20 mL乙酸乙酯，同樣對懸濁液進行萃取3次，合并三次萃取液即可得含有抗氧化劑的萃取液(萃取液呈墨綠色，透明，且產量越高，顏色越深)。

1.3.5 濃縮干燥產物

將恒溫水浴鍋溫度設置為75 ℃，并且置于通風櫥下，將盛有萃取液的燒杯置于水浴鍋中，濃縮產物。用電子分析天平稱取一個干燥的25 mL坩堝，記錄坩堝質量，待產物濃縮至很少時，將濃縮液轉移到干燥坩堝中，小心將坩堝放進烘箱，將烘箱溫度設為60 ℃對產物進行干燥。

1.3.6 取下產物

從烘箱之中取出干燥之后的坩堝，讓坩堝降至常溫，接著用分析天平稱量坩堝即可知產物質量，接著用干燥的藥勺從坩堝表面刮下產物，墨綠色產物即為蘇鐵葉抗氧化劑。

1.4 抗氧化劑的測定

1.4.1 ABTS+溶液的制備

取0.385 g ABTS試劑于50 mL容量瓶中，定容可得14 mM/L的ABTS溶液。

取0.06615 g過硫酸鉀粉末與50 mL容量瓶中，定容可得4.9 mM/L的過硫酸鉀溶液。

將5 mL，14 mM/L的ABTS溶液與5 mL，4.9 mM/L的過硫酸鉀溶液混合，振蕩搖勻，避光靜置16 h后取出。

1.4.2 樣品溶液的制備

由于最小樣品溶液的濃度太低，無法從低到高逐級稀釋，故在此用從高到低稀釋的方法，每次稀釋完都將移液管清洗干凈，保證不對下個濃度產生影響。

取250 mg產品溶于無水乙醇中(產物不溶于水)，定容至50 mL，用移液管取出25 mL于燒杯中，加入25 mL無水乙醇，搖勻，做上標記2。將從標記為2的燒杯中取出25 mL于25 mL無水乙醇混合搖勻，標記為3。以此類推直至標記為9為止。則溶液濃度分別為5 mg/L，2.5 mg/L，1.25 mg/L，0.62 mg/L，0.31 mg/L，0.15 mg/L，0.075 mg/L，0.037 mg/L，0.018 mg/L。1.4.3 工作液的制備

將25 mL，0.02 mol/L的磷酸二氫鉀加入到100 mL的容量瓶中，再加入19.5 mL，0.02 mol/L的氫氧化鈉溶液，最后定容，搖勻，即可得pH=7.4的5 mM/L磷酸鹽緩沖液。

將避光靜置16 h的ABTS+溶液取出倒入燒杯中，逐漸加入緩沖液，并且要測其吸光度，當在波長為734 nm下，吸光度為0.7時(偏差不過0.02)，即可配成工作液。

1.4.4 樣品的測定

取一滴1號樣品溶液于試管中，用移液管加入5 mL工作液，靜置5 min后測吸光度(Asample)，依次處理至9號樣品溶液，最后再取一滴無水乙醇于試管中，用移液管加入5 mL工作液，靜置5 min，再測量其吸光度(Acontrol)，作為標準液。

同樣方法處理抗壞血酸，得到標準對照組(表2)。

1.4.5 半數抑制率的計算

半數抑制率是指在清除率為50%時所消耗的抗氧化劑的濃度，可見公式如下：

清除率=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100%

1.4.6 抗氧化劑的測定結果

樣品的吸光度如表1所示。

表1 濃度-清除率對應表

續表1

06207711977031078618210150907561007509352700037094021900180953083

無水乙醇Acontrol的吸光度為0.961。

由表1可得出：當清除率為50%時，半數抑制率IC50=1.50 mg/mL。

抗壞血酸的吸光度如表2所示。

表2 抗壞血酸清除率對應表

由表2可得出：當清除率為50%時，IC50=0.64 mg/mL。

蘇鐵葉抗氧化劑對比結果如表3所示。

表3 蘇鐵葉抗氧化劑對比表

由表3可知，蘇鐵葉抗氧化劑的清除自由基能力比抗壞血酸還要好，具有較強的抗氧化能力，能夠很好地清除ABTS自由基。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲時間對提取抗氧化劑的關系研究

準確稱量8.0 g干燥蘇鐵葉于燒杯中，準確稱量5份，將統一配置好的75%乙醇倒入100 mL，浸提8 h，浸提結束后，將燒杯放入超聲機中，溫度設為50 ℃，將超聲時間控制為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，分別再進行下面的操作之后，得出以下的實驗結果。

表4 超聲時間與產量關系表

圖2 超聲時間與產量的關系研究

由圖2可知，在超聲時間為1 h以內時，產量相對較少，但是在1 h之后，產量有明顯上升趨勢，并且在2 h時，可得到最大產量，而超過2 h之后，產量又呈下降趨勢。超聲可使原材料中的抗氧化劑通過物理作用振蕩出來，但是超過一定限度之后就會形成反效果，會使產量減少。因此，選擇1 h，1.5 h，2 h，2.5 h進行正交試驗。

2.1.2 浸提時液固比對產量的關系研究

準確稱量6.0 g干燥蘇鐵葉于燒杯中，準確稱量5份，配置好75%乙醇，分別倒入乙醇體積為蘇鐵葉質量的14倍，16倍，18倍，20倍，22倍，浸提8 h，浸提結束后，將燒杯放入超聲機中，溫度設為50 ℃，超聲1 h，分別再進行下面的操作之后，得出實驗結果見表5。

表5 液固比對產量的關系研究表

圖3 液固比對產量的關系研究

由圖3可知，當加入的乙醇體積是蘇鐵葉質量的20倍時，可得到最大產量，在20倍之前都呈上升趨勢，隨著乙醇量的增加而增加，而在20倍時達到飽和，故增加一定量的乙醇可使產量增加。因此，選擇乙醇體積為蘇鐵葉質量的16倍，18倍，20倍，22倍進行正交實驗。

2.1.3 浸提時間對產量的關系研究

準確稱量6.0 g干燥蘇鐵葉于燒杯中，準確稱量5份，將統一配置好的75%乙醇倒入100 mL，分別浸提8 h，9 h，10 h，11 h，12 h，浸提結束后，將燒杯放入超聲機中，溫度設為50 ℃，超聲1 h，分別再進行下面的操作之后，得出實驗結果見表6。

表6 浸提時間與產量的關系研究表

圖4 浸提時間與產量的關系研究

由圖4可知，產量隨浸提時間的增加而增加，在在浸提11 h后，長時間的浸提效果不明顯，故飽和值可判定在11 h處。因此，取浸提時間分別為9 h，10 h，11 h，12 h來進行正交試驗。

2.2 正交試驗優化蘇鐵葉抗氧化劑提取條件

已通過單因素實驗得到一系列有效數據，可以用產量來判斷優化結果，本文選擇用浸提時間，液固比(75%乙醇的體積與蘇鐵葉的質量比)，超聲提取時間三個因素來進行考察，每個因素設三個水平，選擇L16(34)正交表，正交實驗設計如表7～表9所示。

表7 正交實驗設計表

表8 正交實驗結果

續表8

313319341441865212237622117672341718243145931317710324171113311721234219713414200144231761543221616441187均值1184192167均值2199184221均值3179188180均值4195191187極差R430854

表9 方差分析

根據表8中的極差可以看出各因素對蘇鐵葉提取抗氧化劑的影響程度是不一樣的，極差越大，影響越大，其因素影響次序為C(超聲時間)>A(浸提時間)>B(液固比)。表9的方差分析表明，在A,B,C三個因素中，C的影響效果較為明顯，有顯著性，也就是超聲時間對抗氧化劑的提取的影響較大，充分震蕩能夠使抗氧化劑更加徹底的脫離蘇鐵葉，使得產品產率更高。試驗得出最佳水平為A2B1C2，也就是浸提時間在10 h，液固比為14：1，超聲時間為1.5 h時，可得到最高產量。

3 結 論

本文采用了超聲輔助提取蘇鐵葉抗氧化劑的工藝，經過單因素和正交試驗的方法，確定了提取蘇鐵葉抗氧化劑工藝的最佳條件，即浸提時間在10 h，液固比為14：1，超聲時間為1.5 h，最大提取率為0.4%。

從影響提取率的因素來看，并不是液固比越高，超聲時間越長，抗氧化劑的提取率就會越高。當浸提時間到達一定時，在浸提下去不會有更多的產物生成，會浪費制取時間，使得成本增加。而液固比要控制在一定范圍內才好，盲目的增加乙醇體積會造成一定的浪費，也會使得成本上升，超聲時間在1.5 h時，就會達到飽和。

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Study on Preparation of Cycas Leaf Antioxidant and Performance

SONGZhao-feng,ZHAOHai-quan

(Department of Chemical Engineering, School of Environment and Chemical Engineering,Foshan University, Guangdong Foshan 528000, China)

Taking Cycas revolute Thunb as raw material, antioxidant from Cycas revolute Thunb was extracted by ultrasonic wave. Based on a single factor in the experiment, the orthogonal experiment was studied to achieve the purpose of optimizing the extraction process. The best extraction conditions were as follows: extraction time was 10 h, the solid-liquid ratio was 14：1, ultrasonic time was 1.5 h. The study showed that the antioxidants from Cycas revolute Thunb had better scavenging free radicals than identical concentration of vitamin C, and the free radical scavenging effect was enhanced with the increase of the concentration of Cycas revolute Thunb antioxidant.

Cycas revolute Thunb; ultrasonic extraction; extraction process; antioxidants; orthogonal

宋照風(1984-)，女，實驗師，主要從事實驗室工作，研究方向為天然產物的制備和應用。

Q946.3

A

1001-9677(2016)023-0066-05