水提取法對游離煙堿測定的研究*

魏建科，賴東輝，毛寒冰，羅 熹，王加忠，劉 劍，馬云飛，楊 承

(1貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴州 貴陽 550009；2 貴州銅仁煙草公司德江分公司，

貴州 銅仁 565200)

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水提取法對游離煙堿測定的研究*

魏建科1，賴東輝1，毛寒冰1，羅 熹1，王加忠1，劉 劍1，馬云飛2，楊 承2

(1貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴州 貴陽 550009；2 貴州銅仁煙草公司德江分公司，

貴州 銅仁 565200)

主要研究水提取-氣相色譜法對煙草中游離煙堿的測定。首先對游離煙堿測定的內(nèi)標(biāo)、提取時(shí)間與萃取溶劑等進(jìn)行優(yōu)化，確定內(nèi)標(biāo)、提取時(shí)間與萃取溶劑分別為正十六烷、30 min和三氯甲烷。通過基質(zhì)加標(biāo)、緩沖液模擬等實(shí)驗(yàn)，找到了觀測回收率偏低的原因。最后比較了水提取法與pH計(jì)算法測定游離生物堿的差異，結(jié)果表明：絕對含量差異較大，但二者線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.950(極顯著水平)，說明方法之間有較好的一致性。

水提取法；游離煙堿；氣相色譜；pH計(jì)算法

煙堿是煙草中特有的物質(zhì)之一，是通過氮代謝途徑由吡咯烷環(huán)與煙酸結(jié)合形成的生物堿類物質(zhì)。在煙草中一般以游離態(tài)、單質(zhì)子態(tài)和雙質(zhì)子態(tài)三種形式存在[1]，如圖1所示。

圖1 煙堿各形態(tài)之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系及結(jié)構(gòu)

吸煙者的依賴性與煙草及主流煙氣中的煙堿含量有關(guān)，且與其中的游離態(tài)煙堿關(guān)系更為密切。這是因?yàn)榉琴|(zhì)子化的游離煙堿揮發(fā)性特別強(qiáng)，主要存在于煙氣的氣相中，且由于其親脂特性，游離煙堿能被人體快速的吸收，從而刺激中樞神經(jīng)。因此，已有研究表明游離煙堿是導(dǎo)致吸煙者產(chǎn)生依賴性的主要原因之一[2-3]。因此，對煙草中的游離煙堿進(jìn)行定量分析顯得尤為重要。

由于煙草中的煙堿與陰離子形成的鹽均為極易分解的弱酸弱堿鹽，組成比例與pH值密切相關(guān)，且煙草本身足一個(gè)復(fù)雜的非均相體系，所以提取技術(shù)成為煙草游離煙堿測定的關(guān)鍵點(diǎn)，且萃取方法不同，測定結(jié)果也各異，因此，非常有必要對測定方法進(jìn)行深入的研究。現(xiàn)有測定煙草中游離煙堿的方法主要是水溶液提取-色譜法[4]，有機(jī)溶劑提取-紫外分光光度計(jì)法[5]，固相微萃取-色譜法[6]與pH值計(jì)算法[7]。有機(jī)溶劑提取-紫外分光光度計(jì)法需要分別測定總煙堿與結(jié)合態(tài)煙堿，二者之差得到游離煙堿的含量。該方法需要對樣品測定2次，操作步驟較多，耗時(shí)較長。固相微萃取方法由于易受煙末或煙絲的大小、烤煙水分含量等條件的影響，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)差異較大，穩(wěn)定性較差。因此，本研究主要對水溶液提取-色譜法進(jìn)行研究，深入分析觀測回收率的變化，同時(shí)比較pH計(jì)算法與該方法之間的差異。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Trace GC Ultra氣相色譜儀配火焰離子化檢測器，美國THERMO公司； pH測定儀，瑞士METTLER TOLEDO公司；超純水儀，德國MERCK MILLIPORE公司；振蕩提取儀，韓國N-BIOTEK公司；不同體積的移液器及低速離心機(jī)等。

99.99%氫氧化鈉、正十六烷、正十七烷，均購于美國SIGMA公司；pH計(jì)校正緩沖溶液(3點(diǎn)校正，pH=4.00、6.86與9.18)；水為超純水；其它有機(jī)溶劑均為分析純試劑。

1.2 試液及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

pH=7水溶液配制：稱取40 mg的氫氧化鈉，用超純水定容為100 mL，得到0.01 mol/mL的氫氧化鈉溶液。利用0.01 mol/mL 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)去二氧化碳的蒸餾水至pH=7±0.1。內(nèi)標(biāo)溶液配制：稱取99.7 mg的正十六烷于1000 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至刻度得99.7 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取50 mg的煙堿于50 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至刻度得1 mg/mL的煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 游離煙堿提取方法

水溶液提取法：稱取0.25 g煙草粉末于50 mL離心管中，加入10 mL pH=7±0.1提取溶液，渦旋混勻1 min后室溫下260 rpm 振蕩提取30 min，3500 rpm離心5 min，取上層水溶液清液過0.45 um濾膜。準(zhǔn)確移取5 mL濾液于50 mL離心管中，分別加入5 mL的內(nèi)標(biāo)溶液提取游離煙堿2次，渦旋3 min后，3500 rpm離心5 min分層，合并有機(jī)層靜置，取1～2 mL溶液進(jìn)行分析。

pH計(jì)算法：參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行提取，按照如下公式進(jìn)行計(jì)算[9]：

1.3.2 游離煙堿色譜條件

色譜柱為TR-1701(60 m×0.32 mm×0.25 μm)，柱溫為：110 ℃保持1 min，4 ℃/min升至180 ℃保持1 min，再20 ℃/min升至250 ℃保持15 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流進(jìn)樣，0.8 min后30 mL/min吹掃進(jìn)樣口，載氣為氦氣，1.5 mL/min，恒流模式，進(jìn)樣量為 1 μL。火焰離子化檢測器溫度為260 ℃，空氣、氫氣及尾吹氣流量分別為350、35和30 mL/min。在上述色譜條件下，煙堿與正十六烷的出峰時(shí)間分別為：15.58和18.94 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標(biāo)的選擇

文獻(xiàn)中常利用正十七烷為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正[10]，但通過空白比對可知，正十七烷出峰時(shí)間21.22 min有雜質(zhì)峰干擾，而正十六烷18.94 min未有干擾，且正十六烷出峰時(shí)間更接近煙堿，因此，選擇正十六烷為內(nèi)標(biāo)更佳。

2.2 提取時(shí)間與萃取溶劑的選擇

為了考察pH=7±0.1水溶液在不同提取時(shí)間(10、20、30、40 min)的提取回收率，利用10 mL水溶液振蕩提取0.25 g煙草中的游離煙堿，分別向煙草樣品和同一煙草樣品的提取液中添加2.15 mg/g的煙堿，經(jīng)過三氯甲烷萃取后進(jìn)樣，測定提取回收率。結(jié)果在表1中可看出：30 min振蕩提取獲得最大的提取效率，回收率達(dá)到97.8%。

表1 提取時(shí)間對提取回收率的影響

為了考察不同有機(jī)溶劑的萃取效率，分別選擇三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和乙醚進(jìn)行萃取，結(jié)果表明：除三氯甲烷外，其它溶劑的萃取效率都非常低，因此選擇三氯甲烷為萃取溶劑。此外，從表1可以看出，游離煙堿在三氯甲烷萃取階段的回收率仍然較低，只有40%左右，不滿足添加回收率的要求，因此，進(jìn)一步分析三氯甲烷萃取效率較低的原因。

表2 不同溶劑對游離煙堿的萃取效率

2.3 萃取回收率的研究

為了探索游離煙堿萃取階段回收率較低的原因，設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究：

(1)沒有煙草本底的回收率：在pH=7的10 mL水溶液中添加1.15 mg煙堿，振蕩、過濾、移液、萃取后測定回收率；

(2)煙草本底的回收率：將1.15 mg煙堿加入到煙草粉末中進(jìn)行振蕩、過濾、移液、萃取后測定回收率；

(3)煙草本底的回收率：將1.15 mg煙堿加入到10 mL煙草提取液中進(jìn)行振蕩、過濾、移液、萃取后測定回收率；

(4)煙草本底的回收率：將1.15 mg煙堿加入到萃取后的10 mL三氯甲烷中，振蕩混勻后測定回收率。

表3 游離煙堿萃取階段回收率測試

從表3可得，將煙堿添加到煙草基質(zhì)中，對游離煙堿回收率的影響較大，減少了大約60%。推測可能是因?yàn)橥饧訜焿A受到煙草基質(zhì)的影響。考慮到煙堿存在方式受到pH的影響，從而降低其萃取效率。測定了1、2與3中在添加煙堿前后的pH值變化，1中添加前后分別為7.04與8.98，2中的提取液pH為5.55，3中添加前后分別為5.55與5.58，可以看出，可能由于煙草基質(zhì)呈酸性，將添加的部分游離煙堿轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)(與氫離子結(jié)合)，導(dǎo)致回收率較低。此外，pH=7的水添加前后pH值變化較大，而煙草提取液基本未變化，可能原因?yàn)闊煵萏崛∫簽橐环N混合復(fù)雜的緩沖溶液，微量的煙堿加入對pH影響不大。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述猜想，設(shè)計(jì)表4中的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：利用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)煙草提取液的pH值到7.00后進(jìn)行添加，回收率達(dá)到100.5%，此外，利用緩沖液模擬煙草提取液，獲得了類似的結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證觀測回收率較低是煙草基質(zhì)為弱酸性的緩沖溶液導(dǎo)致，也從側(cè)面證明了三氯甲烷能較好的萃取游離態(tài)煙堿。

表4 游離煙堿萃取階段回收率驗(yàn)證

2.4 方法驗(yàn)證

以正十六烷為內(nèi)標(biāo)，將煙堿質(zhì)量/正十六烷質(zhì)量的比值為橫坐標(biāo)(X)，煙堿峰面積/正十六烷峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，內(nèi)標(biāo)法求線性回歸方程，在5～500 μg/mL范圍下，Y=0.6647X-0.0406，R2=0.9997。將方法應(yīng)用于測定同一樣品，在相同天測定5次及5天內(nèi)測定5次檢驗(yàn)其精密度，結(jié)果表明，日內(nèi)(4.04、4.18、4.25、4.10、4.15 RSD=1.92%)與日間精密度(4.18、4.28、4.02、4.15、4.29 RSD=2.63%)較好。以低濃度(5 ug/mL)進(jìn)樣分析，以信噪比(S/N)為3和10計(jì)算其最低檢出限和最低定量限。結(jié)果表明：方法的最低檢測限為0.53 ug/mL和1.76 ug/mL。從上述結(jié)果表明，方法達(dá)到了較好的定量分析要求。圖2為標(biāo)樣與樣品分析的色譜圖。

圖2 標(biāo)樣色譜圖(A)和樣品色譜圖(B)

2.5 水提取法與pH計(jì)算法的比較

對25個(gè)K326烤煙樣品(等級C3F)的游離煙堿分別利用pH水提取法與pH值計(jì)算法進(jìn)行分析，結(jié)果表明：二種方法得到的游離煙堿絕對含量差異較大，水提取法含量普遍高于pH值法，二者比值大約為50倍，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.950，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，說明方法之間有較好的一致性。水提取法通過了游離煙堿回收率、精密度等的驗(yàn)證，因此，利用水提取法測定游離煙堿的含量與變化具有很好的可靠性。

表5 水提取法與pH計(jì)算法對樣品的測定分析

3 結(jié) 論

本文研究了水提取-氣相色譜法測定煙草中的游離煙堿。本方法通過優(yōu)化提取與萃取條件，并與pH計(jì)算法進(jìn)行比較。結(jié)果表明：該方法準(zhǔn)確且可靠，游離煙堿回收率、精密度等都達(dá)到了嚴(yán)格定量的要求。與其它方法相比，該方法操作相對簡單，耗時(shí)較短，且對分析結(jié)果產(chǎn)生影響的因素相對較少，提高了對游離煙堿測定的準(zhǔn)確度。

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Study on Determination of Free-base Nicotine in Flue-cured Tobacco with Water Extraction*

WEIJian-ke1,LAIDong-hui1,MAOHan-bing1,LUOXi1,WANGJia-zhong1,LIUJian1,MAYun-fei2,YANGCheng2

(1 Technology Center of China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd., Guizhou Guiyang 550009; 2 Dejiang County Branch, Tongren Tobacco Company, Guizhou Tongren 565200, China)

Water extraction combined with gas chromatography was used to determination of free-base nicotine in flue-cured tobacco.The internal standard, extraction time and extracting solvent were optimized. The result showed that hexadecane, 30 min extraction time and chloroform were the best choice. The lower observed recovery was explored by matrix addition and simulation of buffer experiment. The reason was that the tobacco aqueous solution was a kind of acidic buffering system. Water extraction and pH calculation methods were compared. The result indicated that the correlation coefficient of two methods was 0.950 (extremely significant level). There is good consistency between two methods.

water extraction; free based nicotine; gas chromatography; pH calculation method

國家煙草專賣局科技重大專項(xiàng)(TS-02-20110014)。

魏建科(1984-)，女，助理工程師，碩士，從事煙草及煙氣化學(xué)分析檢測工作。

劉劍，博士，高級工程師，從事煙草及煙氣化學(xué)分析研究。

TS4

A

1001-9677(2016)023-0092-04