間接酶聯免疫吸附測定河豚魚中河豚毒素*

嚴忠雍, 顧蓓喬, 張小軍, 方 益, 李佩佩, 龍 舉, 高學慧

(1浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021；2 浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316021；3 浙江海洋大學水產學院，浙江 舟山 316021)

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間接酶聯免疫吸附測定河豚魚中河豚毒素*

嚴忠雍1,2, 顧蓓喬1,2, 張小軍1,2, 方 益1,2, 李佩佩1,2, 龍 舉1,2, 高學慧3

(1浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021；2 浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316021；3 浙江海洋大學水產學院，浙江 舟山 316021)

為有效確保食用河豚魚的安全性，進一步監測河豚魚中河豚毒素，本方法應用間接酶聯免疫吸附測定河豚魚中河豚毒素的含量，評估河豚魚的安全風險程度。實驗結果表明，間接酶聯免疫吸附法測定河豚毒素靈敏度高，方法的在線性范圍為2～135 μg/L內有良好的線性關系，且方法的回收率達到82.4%～92.5%，檢出限能達到2 μg/kg。本方法快速、簡單，完全滿足實際工作的需要。

間接酶聯免疫吸附；河豚魚；河豚毒素

河豚毒素(TTX)是一種天然海洋生物神經毒素，分布廣泛，主要存在于河豚魚中，在蟾蜍、藍環章魚、螺類等其他動物體內也有存在。河豚毒素毒性極強，食用0.5 mg就可致人死亡，河豚毒素可通過對細胞納離子通道的阻斷作用而抑制神經沖動的傳導，使感覺神經麻痹，四肢癱瘓，呼吸困難，最后因呼吸抑制而死亡[1-3]。因此每年都有因食河豚魚而導致中毒的事件發生。鑒于河豚中毒的嚴重危害，我國嚴禁河豚鮮售鮮食。但由于人們嗜食習慣和河豚的昂貴的價格，我國鮮河豚非法制售活動屢禁不止。因此建立快速、有效的檢測和控制河豚毒素的方法顯得非常必要。

目前，河豚毒素的檢測方法有生物測定法、高效液相色譜法、氣相色譜質譜法及免疫化學測定法等[4]。其中生物測定法[5-7]一般需要專門動物，適用性差，且操作繁瑣，費時費力重復性差；物理化學檢測法[8-10]雖靈敏度較高，但檢測成本高，儀器昂貴且檢測周期長。酶聯免疫吸附劑測定法[11]靈敏度高、特異性強、檢測成本低，其中國家標準GB/T 5009.206-2007《鮮河豚魚中河豚毒素的測定酶聯免疫》[12]是目前我國檢測河豚魚中河豚毒素時普遍使用的方法。但是該方法前處理非常復雜，且酶聯免疫反應耗時長，操作難度較大。因此，有必要建立一種快速、高效、簡便、靈敏的檢測方法。本研究建立一種以單克隆抗體為基礎的免疫學檢測方法，具有特異性強，靈敏度高快速、操作簡便、經濟快捷的特點，滿足河豚毒素快速篩檢的需要，適合實際檢測工作。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

MK3微孔板酶標儀，美國Thermo Labsystems公司；MS2漩渦混合器，德國IKA公司；Centrifuge5810高速離心機，德國Eppendorf公司；T18勻漿機，德國IKA公司；恒溫孵育箱，上海一恒科技有限公司；純度≥98%的河豚毒素標準品，德國Dr公司；河豚毒素試劑盒，購自江蘇美正生物有限公司。實驗所用其他試劑均為分析純。

1.2 溶液系統

TTX標準溶液：將河豚毒素標準品溶于0.2 mol/L pH：4.0乙酸鹽緩沖液中，配制成濃度為1.0 mg/mL標準儲備液，4 ℃避光保存，保存期為6個月。

1.3 樣品采集與制備

1.3.1 樣品采集

于我國東南沿海11月間野捕河豚魚，采集后低溫冷藏處理，保存在冷凍狀態中運輸至實驗室。

1.3.2 樣品制備

對冷藏樣品解凍后，用蒸餾水清洗魚體表面污物，濾紙吸干，將魚分解成肌肉、肝臟、卵巢(雄性為精囊)等部分，各部分組織分別用蒸餾水洗去血污，濾紙吸干水分后充分均質稱重。

1.4 樣品提取

稱取上述均質樣品(1.00±0.02)g于50 mL聚苯乙烯離心管中，加入樣品提取液1 mL，渦旋振蕩3 min，4000 r/min離心10 min，取50 μL供分析。

1.5 樣品測定

將試劑盒回溫至室溫，加樣品50 μL每孔到微孔中，加河豚毒素抗體試劑每孔50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置孵育箱25 ℃避光反應30 min。揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加洗板液250 μL每孔到微孔中。充分洗滌4次(每次間隔10 s)后，加河豚毒素酶標物溶液100 μL每孔到微孔中，用蓋板膜蓋板25 ℃避光反應30 min，洗滌4次。加入底物液A每孔50 μL,再加入底物液B每孔50 μL，用蓋板膜蓋板置孵育箱25 ℃避光反應15 min。加入終止液50 μL每孔到微孔中，于雙波長450/630 nm測定吸光值。

2 結果與討論

2.1 線性范圍及檢出限

用TTX毒素儲備液分別配制濃度為2，5，15，45，135 μg/L 的標準溶液，用間接ELISA法測定制作校準曲線，如圖1所示。該方法的線性范圍為2～135 μg/L，對TTX的最低檢出限為2 μg/L。

圖1 TTX標準曲線

2.2 加標回收與精密度

在1.00 g陰性河豚魚肉中添加10、40、70、100 μg/kg的TTX標準溶液，每個添加水平平行測定3次，計算其回收率和精密度，見表1。結果表明，方法在10～100 μg/kg之間的添加水平的回收率為82.4%～92.5%，完全符合TTX的檢測要求。

表1 TTX的回收率和相對標準偏差

注：n=3。

2.3 ELISA檢測方法與液相串聯質譜法的比較

用本方法和液相串聯質譜法(采用文獻報道[13]方法)對6份河豚魚肉樣品分別進行TTX檢測，并比對兩種方法的檢測結果，結果如表2所示。由表2可知，兩種檢測方法的測定結果基本符合，并無明顯差異，表明本方法的靈敏度和準確度完全滿足TTX的檢測要求。

表2 ELISA法與液質聯用法的檢測結果

*ND為未檢出。

2.4 實際樣品測定

用本方法對我國東南沿海野捕的10河豚魚樣品進行檢測，檢測發現6個陽性樣品。6個陽性樣品對應的TTX濃度分別為8.92、20.31、82.56、15.84、25.27和37.72 μg/kg，表明野生河豚魚多數帶毒。因此，有必要對河豚魚進行常規監測和嚴格控制。

3 結 論

本方法在原有的檢測標準上進行條件優化，簡化實驗步驟，縮短檢測時間，提高工作效率。本方法的靈敏度和準確度完全滿足日常TTX的檢測需要，適宜推廣于實際工作使用。

[1] 計融,王健偉,羅雪云,等.河豚魚類中河豚毒素直接競爭抑制性酶聯免疫吸附試驗測定方法的研究[J].中國食品衛生雜志,2005,14(5):7-10.

[2] 李世平,焦新安,黃金林,等.河豚毒素兩種定量檢測方法的比較研究[J].揚州大學學報, 2004,25(2):58-60.

[3] 紀元,劉巖,宮慶禮.小鼠生物法和酶聯免疫法(ELISA)定量監測沿海5省養殖河豚魚中的河豚毒素(TTX)[J].水產學報,2010,34(4):589-597.

[4] 周曉翠,謝光洪,劉國文,等.河豚毒素檢測方法的研究進展[J].中國畜牧獸醫,2008,35(7):43-45.

[5] 張理,謝克勤,趙金山,等.用昆明小鼠定量測試河豚毒素的研究[J].中國食品衛生雜志,2004,16(6):497-500.

[6] 段發淼,謝心磊,朱寶平.用小鼠單位法檢測河豚毒素[J].中國衛生檢驗雜志,2000,10(4):463-464.

[7] 林蔚,林健,黃宗銹.用ICR小鼠生物法測定烤魚片河豚毒素的研究[J].海峽預防醫學雜志,2008,14(4):49-50.

[8] 陳唯真,朱偉華,俞如英.HPLC法測定河豚毒素的含量及穩定性[J].藥物分析雜志,2004,24(1):41-43.

[9] Margaret A O’leary, Jennifer J Schneider, Geoffrey K Isbister. Use of high performance liquid chromatography to measure tetrodotoxin in serum and urine of poisoned patitents[J].Toxicon,2004(44):549-553.

[10]張虹,柳正良,黃蓓琳,等.反向離子對-高效液相色譜法測定河豚毒素[J].中國現代應用藥學雜志,2001,18(3):197-198.

[11]宮慧芝,計融,江濤,等.河豚毒素單抗ELISA檢測試劑盒的研制[J].中國公共衛生,2005,21(12):1423-1424.

[12]國家標準GB/T 5009.206-2007鮮河豚魚中河豚毒素的測定酶聯免疫[S].2007.

[13]李愛峰,于仁成,周名江.液相色譜-電噴霧離子阱質譜聯用分析河豚毒素[J].分析化學,2007,35(3):397-400.

Determination of Tetrodotoxin in Puffer by Indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay*

YANZhong-yong1,2,GUBei-qiao1，2,ZHANGXiao-jun1，2,FANGYi1,2,LIPei-pei1,2,LONGJu1,2,GAOXue-hui3

(1 Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhejiang Zhoushan 316021; 2 Key Lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang, Zhejiang Zhoushan 316021; 3 Zhejiang Ocean University,Zhejiang Zhoushan 316021, China)

An indirect ELISA method was developed to monitor tetrodotoxin in puffer and assess the security risk level of the puffer. The indirect ELISA method ensured the safety of puffer fish consumption and monitoring of tetrodotoxin in puffer fish. The indirect ELISA method was sensitive, the quantification limit of the method was 2 μg/kg with satisfactory sensitive. The recovery of tetrodotoxin was 82.4%～92.5% in the range of 2～135 μg/L. The method was rapid and simple, met the needs of practical work.

indirect enzyme-linked immunosorbent assay; puffer; tetrodotoxin

浙江省科研院所公共科技服務項目(2016F30020)；舟山市科技計劃項目(2015C31011)。

嚴忠雍(1990-)，男，助理工程師，學士，主要從事漁業環境監測和水產品質量安全研究。

O656.31

B

1001-9677(2016)023-0098-03