化學(xué)物(藥物)毒性測(cè)試替代體系的建立及應(yīng)用

施 暢，馬華智，王全軍，吳純啟，原 野，石富江，荊淑芳，王建京，廖明陽(yáng)

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850)

專題研究

化學(xué)物(藥物)毒性測(cè)試替代體系的建立及應(yīng)用

施 暢，馬華智，王全軍，吳純啟，原 野，石富江，荊淑芳，王建京，廖明陽(yáng)

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850)

當(dāng)前對(duì)化學(xué)物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)的整體動(dòng)物試驗(yàn)由于試驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高，存在種屬差異和劑量差異，導(dǎo)致其實(shí)驗(yàn)結(jié)果在預(yù)測(cè)人體毒性風(fēng)險(xiǎn)時(shí)受到一定的限制。本研究針對(duì)化學(xué)物安全性評(píng)價(jià)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估所依賴的毒作用終點(diǎn)(遺傳毒性、致癌性、生殖毒性、急性毒性、一般毒性)，按照動(dòng)物試驗(yàn)替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則，建立相應(yīng)的毒性測(cè)試替代篩選體系。該體系涵蓋毒性評(píng)價(jià)的絕大多數(shù)終點(diǎn)，并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)毒性試驗(yàn)進(jìn)行整合，優(yōu)化了多種動(dòng)物試驗(yàn)操作方法，以期縮短實(shí)驗(yàn)周期、降低實(shí)驗(yàn)成本、提高動(dòng)物福利。同時(shí)該體系是基于毒作用機(jī)制進(jìn)行的毒性評(píng)價(jià)，因此試驗(yàn)結(jié)果具有較高的人體相關(guān)性。

毒性測(cè)試；替代策略；減少性替代；替代性研究；優(yōu)化性替代

1 研究背景

1.1 化學(xué)物毒性測(cè)試面臨的挑戰(zhàn)

隨著科學(xué)技術(shù)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的快速發(fā)展，新化學(xué)物質(zhì)不斷增多，人們?cè)谌粘９ぷ骱蜕钪型ㄟ^(guò)各種途徑接觸工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品、食品、日用和醫(yī)用化學(xué)品及空氣中的化學(xué)物質(zhì)越來(lái)越多，其中大部分化學(xué)物缺乏系統(tǒng)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，難以正確評(píng)價(jià)其安全性，對(duì)人類和環(huán)境構(gòu)成了潛在的危害?；瘜W(xué)物的增多也導(dǎo)致時(shí)有潛在危害的存在及中毒事故的發(fā)生，因此急需對(duì)各種已知和未知的化學(xué)物進(jìn)行毒性測(cè)試，以適應(yīng)管理部門處理災(zāi)情、制定衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的需要，并保障產(chǎn)品安全和環(huán)境安全。

傳統(tǒng)的毒性測(cè)試主要依賴于整體動(dòng)物試驗(yàn)，由于以下幾方面原因，動(dòng)物試驗(yàn)難以滿足當(dāng)前化學(xué)物毒性評(píng)價(jià)的巨大需求[1,2]。(1)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高。當(dāng)前由于生產(chǎn)、生活的需要，新化學(xué)物質(zhì)不斷被合成，人們接觸各類化合物的途徑和接觸量也隨之增多，可想而知對(duì)所有化合物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)將耗費(fèi)大量的時(shí)間、人力和財(cái)力。(2)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果在預(yù)測(cè)人體毒性風(fēng)險(xiǎn)時(shí)存在一定的限制，主要有兩方面原因：一是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體存在種屬差異，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在用于預(yù)測(cè)人體毒性時(shí)需要進(jìn)行種屬外推，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳背景、飼養(yǎng)環(huán)境和接觸化學(xué)物的途徑均相同，而現(xiàn)實(shí)生活中接觸化學(xué)物的人群則在遺傳背景、接觸途徑、個(gè)體生理環(huán)境等方面千差萬(wàn)別；二是長(zhǎng)期以來(lái)整體動(dòng)物試驗(yàn)所采用的劑量遠(yuǎn)高于人體實(shí)際暴露量，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果還存在劑量外推的問(wèn)題。(3)整體動(dòng)物試驗(yàn)大多提供的是基于器官或細(xì)胞水平的毒性表現(xiàn)、毒作用特征、可能的毒作用靶器官以及毒性是否可逆，很少能夠提供確切的毒性機(jī)制和發(fā)生在亞細(xì)胞水平的有害作用的原發(fā)病因，難以為監(jiān)管部門的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)、制定管理措施及處理災(zāi)情等提供有用的信息。

1.2 “3R”原則和毒性測(cè)試替代策略“3R”原則的核心內(nèi)容為減少( reduction )、替代( replacement ) 和優(yōu)化( refinement)，其主要目的是在保證科學(xué)性的前提下，通過(guò)采用體外試驗(yàn)、改進(jìn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作、改善動(dòng)物生存的環(huán)境等措施減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，減輕因?qū)嶒?yàn)操作導(dǎo)致動(dòng)物的不適或痛苦，提高動(dòng)物福利[3]。減少性替代是指使用較少的動(dòng)物獲得相同的信息或者使用同等數(shù)量的動(dòng)物獲得更多的信息，或縮短動(dòng)物實(shí)驗(yàn)周期。替代性研究主要是指采用無(wú)脊椎動(dòng)物或人道獲取的脊椎動(dòng)物細(xì)胞、組織、器官進(jìn)行體外研究。優(yōu)化性替代主要是指在動(dòng)物飼養(yǎng)及試驗(yàn)過(guò)程中，改善飼養(yǎng)環(huán)境，引入新技術(shù)新方法，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作，以減輕動(dòng)物的不適或痛苦。

目前歐盟、美國(guó)和日本等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)已普遍制定了動(dòng)物福利的法律法規(guī)，歐洲還成立了替代方法驗(yàn)證中心，通過(guò)多渠道推廣貫徹“3R”原則。在我國(guó)“3R”原則的貫徹也取得了一些進(jìn)展，如1997年科技部在《關(guān)于“九五”期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展的若干意見(jiàn)》中提出建立與國(guó)際接軌的動(dòng)物福利保障制度，到2006 年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》指出動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循“3R”原則。故此采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、體外培養(yǎng)的細(xì)胞、組織器官或低等生物等試驗(yàn)系統(tǒng)替代傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已成為化學(xué)物毒性測(cè)試的重要發(fā)展方向。同時(shí)計(jì)算機(jī)模擬程序和細(xì)胞分子生物學(xué)新技術(shù)新方法的引入，使得化學(xué)物毒性評(píng)價(jià)已發(fā)展為基于毒作用機(jī)制研究的的毒性測(cè)試新模式。

毒性測(cè)試替代策略即針對(duì)化學(xué)物的毒性或特定毒性終點(diǎn)(遺傳毒性、致癌性、生殖毒性、急性毒性、一般毒性等)，采用與傳統(tǒng)動(dòng)物試驗(yàn)毒性評(píng)價(jià)方式不同的體外、短期的測(cè)試方案對(duì)化學(xué)物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，在縮短實(shí)驗(yàn)周期、降低實(shí)驗(yàn)成本、提高動(dòng)物福利的同時(shí)為危害識(shí)別和劑量-反應(yīng)評(píng)估提供信息，由于該體系是基于毒作用機(jī)制進(jìn)行的毒性評(píng)價(jià)，因此試驗(yàn)結(jié)果具有較高的人體相關(guān)性。

2 研究目的及成果

本項(xiàng)目針對(duì)化學(xué)物毒性測(cè)試及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估所依賴的毒作用終點(diǎn)(遺傳毒性、致癌性、生殖毒性、急性毒性和一般毒性)，建立了相應(yīng)的短期毒性測(cè)試替代方法，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)毒性試驗(yàn)進(jìn)行整合，并優(yōu)化了多種動(dòng)物試驗(yàn)操作方法，以期縮短實(shí)驗(yàn)周期、降低實(shí)驗(yàn)成本、提高動(dòng)物福利，取得良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

2.1 遺傳毒性測(cè)試替代方法

建立Ames波動(dòng)試驗(yàn)、小鼠淋巴瘤試驗(yàn)(MLA)、質(zhì)粒DNA斷裂試驗(yàn)、體外微核試驗(yàn)。

2.2 重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)伴隨微核試驗(yàn)

建立流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血微核方法，將體內(nèi)微核試驗(yàn)整合于重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。

2.3 致癌性測(cè)試替代方法

建立轉(zhuǎn)基因小鼠短期致癌性試驗(yàn)。

2.4 生殖毒性測(cè)試替代方法

建立大鼠胚胎中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)并優(yōu)化大鼠胎仔骨骼染色法。

2.5 急性毒性測(cè)試替代方法

建立急性毒性上下法、固定劑量法和體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法。

2.6 一般毒性測(cè)試替代方法

優(yōu)化了多種動(dòng)物試驗(yàn)操作方法，發(fā)明了一種擬生境型實(shí)驗(yàn)猴籠，引進(jìn)嚙齒類和實(shí)驗(yàn)猴的環(huán)境裝飾，改進(jìn)嚙齒類、Beagle犬和實(shí)驗(yàn)猴的給藥和保定器械。

3 創(chuàng)新點(diǎn)

本項(xiàng)目建立的毒性測(cè)試替代篩選體系有如下創(chuàng)新點(diǎn)：1、全面系統(tǒng)：涵蓋毒性評(píng)價(jià)的絕大多數(shù)終點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)周期短，快速、高通量，所用樣品量少，可為化學(xué)物危險(xiǎn)管理提供必須的非臨床研究資料。2、應(yīng)用范圍廣：該系統(tǒng)既可應(yīng)用于大量的藥物前體或候選藥物的早期毒性優(yōu)化篩選，又可應(yīng)用于法規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)，并減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，縮短評(píng)價(jià)周期，大大降低人力、物力和財(cái)力。3、技術(shù)領(lǐng)先：以毒性作用機(jī)制為基礎(chǔ)，使毒性試驗(yàn)結(jié)果具有較高的人體相關(guān)性；4、獲得實(shí)用新型專利：一種擬生境型實(shí)驗(yàn)猴籠和一種胎仔骨骼批量染色箱。

4 討論

本項(xiàng)目建立的毒性測(cè)試替代篩選體系涵蓋了毒性評(píng)價(jià)的絕大多數(shù)終點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性方面與當(dāng)前傳統(tǒng)的毒性試驗(yàn)相當(dāng)，同時(shí)在減少動(dòng)物使用、提高動(dòng)物福利、縮短試驗(yàn)周期、減少人力物力方面各有優(yōu)勢(shì)。

在遺傳毒性方面，Ames波動(dòng)試驗(yàn)、小鼠淋巴瘤試驗(yàn)、體外微核試驗(yàn)與傳統(tǒng)的Ames試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)相比，均有較高的一致性[4-6]，且MLA能夠同時(shí)檢出誘變劑和裂變劑，較動(dòng)物體內(nèi)染色體畸變或微核試驗(yàn)檢測(cè)的突變譜更廣，體外微核試驗(yàn)還避免了動(dòng)物的使用。外周血微核流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不僅可將微核試驗(yàn)與一般毒性試驗(yàn)進(jìn)行整合，減少動(dòng)物的使用，同時(shí)因無(wú)需人工閱片，大大減少了人力，提高效率，避免了人工閱片的主觀性。

致癌性試驗(yàn)方面，哺乳動(dòng)物長(zhǎng)期致癌性試驗(yàn)要求動(dòng)物數(shù)多，消耗的化合物量大，耗時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)用高，腫瘤自發(fā)率高，種類多，對(duì)病理人員的要求較高，結(jié)果的假陽(yáng)性率和假陰性率高，敏感性特異性較低，腫瘤的發(fā)生與人類流行病學(xué)無(wú)一致性，因此外推至人較為困難。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的短期致癌試驗(yàn)周期短，使用動(dòng)物數(shù)量少，化學(xué)物用量少，敏感性特異性均高于哺乳動(dòng)物長(zhǎng)期致癌性試驗(yàn)[7]。

生殖毒性方面，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ段體內(nèi)生殖毒性試驗(yàn)貫穿整個(gè)生殖周期，動(dòng)物和樣品的消耗量大，試驗(yàn)操作較復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高，顯然難以用于大量化學(xué)致畸物的快速篩選。大鼠胚胎中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)中，大鼠孕13 d的胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞處于分化前期，對(duì)化學(xué)毒物的作用非常敏感，而且試驗(yàn)周期短，重現(xiàn)性好，在致畸物的快速篩選方面有明顯優(yōu)勢(shì)[8]。

急性毒性方面，傳統(tǒng)的以測(cè)定LD50值為目的的急性毒性試驗(yàn)需耗費(fèi)大量動(dòng)物，隨著急性毒性試驗(yàn)在化學(xué)物毒性評(píng)價(jià)中作用和地位的改變，急性毒性的檢測(cè)終點(diǎn)也發(fā)生了變化，并不一定都要得出LD50值。針對(duì)化學(xué)物的特點(diǎn)通過(guò)上下法或固定劑量法進(jìn)行急性毒性，即能得到所需的相關(guān)信息，極大地減少了動(dòng)物的使用。

此外，本項(xiàng)目發(fā)明的擬生境型實(shí)驗(yàn)猴籠，引進(jìn)的嚙齒類和實(shí)驗(yàn)猴的環(huán)境裝飾，改進(jìn)的嚙齒類動(dòng)物、Beagle犬和實(shí)驗(yàn)猴的給藥和保定器械均有助于提高動(dòng)物福利、減輕動(dòng)物痛苦。

本項(xiàng)目以委托課題的形式廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)多家單位，周期短、成本低，極大地支持了應(yīng)用單位新藥的研發(fā)，取得了較好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，得到了應(yīng)用單位的高度評(píng)價(jià)。

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Establishment and application of toxicity testing alternative system for chemicals(new drugs)

SHI Chang, MA Hua-zhi, WANG Quan-jun, WU Chun-qi, YUAN Ye, SHI Fu-jiang, JING Shu-fang, WANG Jian-jing, LIAO Ming-yang

(Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology, State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

There are some shortcomings of animal experiments applied in chemical toxicity testing, such as long period, large cost, species differences and dose differences, which limit the use of animal experiments’ results in predicting human toxicity. Accordingly, we established a toxicity testing alternative screening system in line with the toxicity endpoints which required in chemical safety evaluation and risk assessment (genotoxicity, carcinogenicity, reproductive toxicity, acute toxicity and general toxicity) based on “3R” principles (replacement, reduction, refinement) for animal experiments. This system covers most of the endpoints of toxicity assessment, and molecular biology technology was also applied to integrate the toxicity test, as well as some operation was optimized in order to shorten the experimental period, reduce experimental costs, improve animal welfare. Furthermore, the results from the screening system have higher clinical relevance because it is based on the toxicity mechanisms.

Toxicity testing; Alternative strategy; Replacement; Reduction; Refinement

北京市科委科技計(jì)劃項(xiàng)目(H030230150130)；國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題(2008ZX09305-003，2012ZX09301-003-008，2013ZX09301303)。

施暢(1972-)女，副研究員，研究方向：藥物毒理及臨床前安全性評(píng)價(jià)。E-mail： shichang1231@foxmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0006-03

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.003

2016-11-18