小型豬慢性心肌缺血模型的建立與無創遙測技術的應用

陳民利，潘永明，陳 亮，徐孝平，王德軍，楊玉偉，陳方明，蔡月琴，徐劍欽，朱科燕

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究所，杭州 310053)

專題研究

小型豬慢性心肌缺血模型的建立與無創遙測技術的應用

陳民利，潘永明，陳 亮，徐孝平，王德軍，楊玉偉，陳方明，蔡月琴，徐劍欽，朱科燕

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究所，杭州 310053)

為建立小型豬慢性心肌缺血模型和應用無創遙測技術的評價方法，本研究采用維生素D3和異丙腎上腺素復合高脂飲食的方法建立了小型豬慢性心肌缺血模型；并利用無創遙測技術對小型豬慢性心肌缺血模型的癥狀進行檢測與評價，同時對五指山小型豬、巴馬小型豬和西藏小型豬的運輸應激和高脂誘導發生動脈粥樣硬化(AS)的危險因素進行評估。建立了巴馬小型豬慢性心肌缺血模型與評價技術規范，明確了無創遙測技術可用于心肌缺血模型的癥狀檢測和評價，界定了小型豬運輸應激后需4周以上的適應恢復期。并發現了高脂環境下五指山小型豬、巴馬小型豬和西藏小型豬發生高血脂、高血壓、高胰島素血癥等AS危險因素的不同特征，這為小型豬在心血管疾病研究中的選擇和應用提供參考。

小型豬；慢性心肌缺血；無創遙測技術；動脈粥樣硬化；心率變異性；適應恢復期

1 研究背景

心血管疾病是嚴重危害人民健康的常見病、多發病之一。冠狀動脈性心臟病又稱缺血性心臟病，簡稱冠心病，是一種嚴重的心血管系統疾病，已成為死亡的主要原因之一。隨著我國的改革開放，經濟迅猛發展，人們的生活水平、方式、節奏、社會和心理壓力都發生了改變，缺血性心臟病的發病率與病死率逐年增加，危險因素水平仍在不斷增高，主要表現在人口老齡化加劇、人群血清總膽固醇水平增高、高血壓患病率在增加、吸煙仍很普遍，預示了我國人群冠心病發病危險的巨大的“冰山底座”[1]。因此，對缺血性心臟病的治療一直是人們所關注的熱點之一。特別是冠心病心絞痛的發病機制受到世人的矚目，找出對缺血性心臟病行之有效的防治手段己是需要迫切解決的問題。

1.1 心肌缺血動物模型的建立是研究該疾病病理機制和治療藥物療效評價的關鍵環節。

幾十年來，藥理學工作者在探索心肌缺血損傷機理及研究藥理作用的同時，建立了不同水平的動物模型，如在體、離體及細胞水平心肌缺血模型。在體動物心肌缺血模型有藥物造模和手術造模兩大類[2-4]，但目前建立的心肌缺血模型多為冠狀動脈結扎法、藥物注射方法等，均是借助物理、化學方法使血管急性阻塞造成心肌急性缺血，與心肌缺血臨床發病機制有很大差異。并存在選擇模型局限、單一及不盡完善等問題，如存在方法學問題、動物種屬問題、干擾因素問題、模型的穩定性和可靠性問題，模型的評價和觀察指標的檢測問題。如現有的手術造模大多需要復雜的開胸手術，對動物損傷大，制備心肌缺血模型的方法有些為慢性機械壓迫冠狀動脈方法，也需要復雜的開胸手術，對動物亦有一定的影響，干擾生理和病理功能。其中采用較多的是在豬冠狀動脈左旋支或降支上采用Ameriod縮窄環進行縮窄冠狀動脈造成心肌缺血，但該技術方法與慢性心肌缺血模型形成的病理機制不是很理想[5]，其縮窄環不可逆轉，對新藥研究評價中藥物有效性評價帶來一定的差異，因此，迫切尋找一種理想的與臨床疾病發生符合程度高的動物模型[6]。本項目利用豬在心血管形態學、生理學和AS易感性方面與人類最為接近的特點[7]，結合心肌缺血模型的藥物注射方法，用高脂飲食的方法，造成豬慢性心肌缺血，并用異丙腎上腺素注射加強心肌缺血的敏感性，可模擬臨床上突發性冠心病的誘發，建立與臨床發生相似、穩定性和重復性好的小型豬慢性心肌缺血模型。

1.2 疾病動物模型病理癥狀的檢測手段和評價技術是模型得到應用的關鍵技術。

動物心肌缺血模型的檢測手段大多為心電圖、心功能、生化檢測、心肌組織病理檢查，主要用于急性實驗研究，其檢測手段極為局限，且必須在麻醉、束縛下進行，只能短時間檢測，既受麻醉、操作和手術的影響，又受時間的局限性，而心肌組織病理檢查在動物處死后進行，動物不能存活使藥物治療的觀察受到限制，無法進一步觀察疾病癥狀的發展過程，使用量大、動物個體差異大、實驗的可靠性低。因此迫切需要尋找能在清醒狀態下的有效的檢測手段。動態心電圖檢測和心率變異性分析(HRV)是臨床心血管領域中非創傷性檢查的重要診斷手段之一，HRV為評估心臟自主神經活動的客觀指標，可評價和預測冠心病患者冠狀動脈病變范圍和嚴重程度及冠脈痙攣嚴重性[8]。根據臨床進行動態心電圖檢測和心率變異性分析的診斷手段，國際上廣泛應用利用遙測技術進行動物在清醒狀態下的檢測，以減少對動物的反復麻醉、捆綁、導線連接等操作，減少由于實驗操作而引起血壓、心率和體溫等生理參數的變化，保證實驗數據的可靠性[9-11]；使用遙測技術可連續記錄動物的生理信號，觀察藥物的起效和毒性發生的時間，確保動物的生理病理機制和藥物評價結果；同時，不用處死動物，避免了動物福利受損問題，達到“減少、代替、優化”的“3R”原則；QT延長對心肌缺血疾病中具有重要的病理意義，是預測心肌缺血的重要指標，使用遙測技術可在動物清醒狀態下連續監測分析QT的變化，可有效評價藥物對心肌缺血疾病的有效性[12，13]。本項目利用無創遙測技術，對動物進行清醒狀態下的動態心電圖檢測和心率變異性分析，并以血清酶、心肌代謝和血液流變等血液生化指標進行輔助評價，建立豬慢性心肌缺血模型的動態檢測和評價技術規范。

2 研究目的

針對以往豬慢性心肌缺血模型制作的不足，本研究首先以高脂血癥導致AS、引起冠狀動脈梗阻或狹窄的機理，采用高脂飲食的方法，造成豬慢性心肌缺血，并用異丙腎上腺素注射加強心肌缺血的敏感性，模擬臨床上突發性冠心病的誘發，建立小型豬慢性心肌缺血模型。該研究模型避免了手術損傷，與臨床發生相似，穩定性和重復性好，影響因素少，比較適合于冠心病的防治研究和新藥藥效學的評價研究。同時應用無創遙測技術進行心肌缺血模型的癥狀檢測和評價，在清醒狀態下進行長時間連續的動態心電圖檢測和心率變異性分析，在一定程度上能反映出模型動物病理改變的發生、發展過程，并結合心肌酶、血脂、自由基、心肌能量代謝、血液凝聚性及電解質指標等血液生化指標進行輔助評價研究，為小型豬慢性心肌缺血模型的評價技術規范的建立提供依據。

考慮到國內一些小型豬在心血管疾病應用中可能存在特殊性，本研究有目的地選擇了五指山小型豬、巴馬小型豬、西藏小型豬，探討了這3種小型豬發生高血脂、高血壓、高胰島素血癥等AS危險因素的不同特征。并利用無創遙測技術結合血液生化指標評估這3種小型豬的運輸應激反應情況，界定小型豬的運輸應激后的適應恢復期，為小型豬在生物醫學領域中的實際應用提供基礎。

3 創新點

以維生素D3和異丙腎上腺素復合高脂飲食誘導，率先建立了非外科手術方式的巴馬小型豬慢性心肌缺血模型，并建立了小型豬慢性心肌缺血模型的評價技術規范，確定了無創遙測技術可用于心肌缺血模型的癥狀檢測和評價，而心肌酶、心肌能量代謝及電解質等血液生化指標可作為輔助評價手段。同時，界定出了小型豬在運輸應激后應至少維持4周以上的適應恢復期，并發現了五指山小型豬、巴馬小型豬、西藏小型豬的AS模型特點及其發生AS危險因素的不同特征。

4 討論

本項目建立的小型豬慢性心肌缺血模型，既模擬了人類在高脂環境下AS的形成過程，符合人類慢性心肌缺血的過程，具有血液粘滯、脂質代謝、心肌酶代謝異常和AS的特點，又模擬了臨床上應激引起的突發性冠心病事件，其病癥、病程特點與人類發生AS和冠心病突發事件引起缺血性心肌病類似，且避免了手術造模的損傷，模型穩定性和重復性好，影響因素少，是比較理想的、適合于冠心病的防治研究和新藥藥效學的評價研究的小型豬慢性心肌缺血模型。

本項目結合無創生理遙測技術和HRV分析手段，以血清酶、心肌代謝和血液流變等為輔助評價指標，建立了豬慢性心肌缺血模型的動態檢測和評價技術規范。利用遙測技術，可同時檢測多種指標的優勢，可減少了不同試驗次數，并可使各項指標之間的關聯性增強。該模型可進行較長時間連續動態觀察的特點，使得試驗結果更完整，并具有系統性。在一定程度上能反映出模型動物病理改變的發生、發展過程，反映出藥物治療的作用環節和作用特點。

本項目還對五指山小型豬、巴馬小型豬和西藏小型豬的運輸應激進行了評估，界定出了小型豬在運輸應激后應至少維持4周以上的適應恢復期，為小型豬的實際應用和動物福利評估提供參考和技術方法。并探討了五指山小型豬、巴馬小型豬、西藏小型豬的發生AS的危險因素的不同特征，為這3種小型豬在心血管疾病研究中的選擇和應用提供了參考，也為我國各品種小型豬在生物醫學研究領域中的開發應用提供了研究思路和技術方法。

[1] 張海澄, 郭繼鴻.冠心病流行病學與一級預防[J]. 中國實用內科雜志, 2002, 22 (8):449-451.

[2] Hoffmann U, Millea R, Enzweiler C,etal. Acute myocardial infarction: Contrast enhanced multi-detector row CT in a porcine model [J]. Radiology, 2004, 231 (3): 697-701.

[3] 呂雄文,陳衛東,金涌,等.卡托普利和低劑量阿司匹林相互作用對大鼠實驗性心肌缺血及肝微粒體酶活性的影響[J].中國藥理學通報, 2004, 20 (1): 104-109.

[4] 季曉平,張運,葛志明,等.慢性心肌冬眠動物模型的建立[J].山東醫科大學學報, 2001, 39 (6):517-519.

[5] Radke PW, Heinlgreen A, Frass OM,etal. Evaluation of the Porcine Ameroid Constrictor Model of Chronic Myocardial Ischemia for Therapeutic Angiogenesis Studies[J]. Endothelium, 2006, 13(1):25-33.

[6] 祝曙光, 熊利華, 謝鴻發,等.小型豬慢性缺血性心臟病模型的建立[J]. 中國臨床康復, 2006,10(20):46-48.

[7] Spetzger U, Reul J, Weis J,etal. Microsurgically produced bifurcation aneurysms in a rabbit model for endovascular coil embolization[J]. J Neurosurg, 1996, 85(3):488-495.

[8] 許宜冠，周勝華，沈向前，等．冠心病患者冠狀動脈病變與心率變異性的關系[J]．臨床心電學雜志，2005,14(2):92-95．

[9] Chiueh CC, Kopin IJ. Hyperresponsivity of spontaneously hypertensive rat to indirect measurement of blood pressure [J]. Am J Physiol, 1978, 234(6):690-695.[10] Clement JG, Mills P. Brockway B. Use of telemetry to record body temperature and activity in mice [J]. J Pharm Meth, 1989, 21(2):129-140.

[11] Livezey GT, Miller JM, Vogel WH. Plasma norepinephrine, epinephrine·and corticosterone stress responses to restraint in individual male and female rats and their correlations [J]. Neurosci Lett, 1985, 62(1):51-56.

[12] Yang HT, Ogilvie RW, Terjung RL. Exercise training enhances basic fibroblast growth factor-induced collateral blood flow [J]. Am J Physiol, 1998, 274(6 Pt 2):2053-2061.

[13] Dan M. Roden, 李輝. 藥物導致的QT間期延長[J].中國心血管雜志, 2008,13(1):74-75.

Establishment of chronic myocardial ischemia model in minipigs and application of noninvasive telemetry technique

CHEN Min-li, PAN Yong-ming, CHEN Liang, XU Xiao-ping, WANG De-jun, YANG Yu-wei, CHEN Fang-ming, CAI Yue-qin, XU Jian-qin, ZHU Ke-yan

(Laboratory Animal Research Center/ Comparative Medical Research Institute, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

In order to establish the minipig model of chronic myocardial ischemia and apply non-invasive telemetry technique, the minipig model of chronic myocardial ischemia was made induced by Vitamin D3, isoproterenol and combined with high fat diet, and the non-invasive telemetry technique was used to detect and evaluate the symptoms of minipig model of chronic myocardial ischemia. Moreover, the effects of transport stress and the risk factors of atherosclerosis (AS) induced by high fat diet among Wuzhishan minipigs, Bama minipigs and Tibetan minipigs were also evaluated. Our study has successful established the Bama minipig model of chronic myocardial ischemia and the technical specification for evaluation,. The non-invasive telemetry technique can be used to detect and evaluate the symptoms of chronic myocardial ischemia model, and defines minipigs at least need to keep for more than 4 weeks after transport stress to adaptive recovery period. In addition, the different characteristics of AS risk factors such as hyperlipidemia, hypertension and hyperinsulinemia were observed in Wuzhishan minipigs, Bama minipigs and Tibetan minipigs in high fat environment, and this provides a reference for the selection and application of minipigs in the research of cardiovascular diseases.

Minipig; Chronic myocardial ischemia; Non-invasive telemetry technique; Atherosclerosis; Heart rate variability; Adaptive recovery period

省部共建科研基金(WKJ2009-2-032)；浙江中醫藥大學比較醫學創新團隊(XTD201301)。

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向：實驗動物與比較醫學。E-mail: cmli991@aliyun.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0016-03

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.006

2016-11-14