基于納米金等離子體共振光散射法測定阿米卡星

鄒明靜，王 娜

(1.菏澤醫學?？茖W校中心實驗室，山東菏澤 274030；2.商丘醫學高等?？茖W校，河南商丘 476000)

基于納米金等離子體共振光散射法測定阿米卡星

鄒明靜1，王 娜2

(1.菏澤醫學?？茖W校中心實驗室，山東菏澤 274030；2.商丘醫學高等專科學校，河南商丘 476000)

為簡便、快速地對阿米卡星的注射液進行檢測，基于納米金顆粒的等離子體共振效應建立了一種檢測阿米卡星的新方法。在適宜pH值的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中，利用阿米卡星與納米金相互作用，使反應體系在640 nm處共振光散射信號顯著增強，且共振光散射強度增強值ΔI640 nm與阿米卡星質量濃度在1.5～500 ng/mL范圍內線性相關，檢出限為0.52 ng/mL。在確定的實驗條件下，阿米卡星可誘導納米金顆粒聚集，納米金顆粒之間距離的變化使其等離子體共振效應發生明顯改變，聚集的納米金顆粒表面等離子體耦合產生了較強的共振光散射信號，且共振光散射信號增強值與阿米卡星的濃度變化值呈現良好的線性關系。實驗表明，該方法可用于快速測定阿米卡星。

光譜分析；納米金；阿米卡星；等離子體效應；共振光散射

阿米卡星為氨基糖苷類抗生素，對多數腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌及部分其他假單胞菌、產堿桿菌屬等具有較好的抗菌活性，臨床上用于抗感染治療，是一種廣譜抗生素[1]。目前測定阿米卡星的方法主要有微生物法、高效液相色譜法、熒光法、化學發光法、毛細管電泳法等[2-6]。微生物法可真實反映生物效價，但操作復雜，靈敏度低且耗時。由于阿米卡星結構缺乏生色基團，熒光法在測定前多需采用熒光試劑或其他試劑進行衍生，導致操作方法繁瑣，實驗干擾因素較多。高效液相色譜法靈敏，結果可靠，但仍采用柱前衍生，繁瑣的檢測過程及較為昂貴的檢測成本限制了其應用。納米金顆粒具有量子效應和表面效應，在化學、醫藥和材料學等諸多領域中得到了廣泛應用[7-8]。

納米金顆?？梢蛘T導作用發生聚集，納米顆粒之間距離的變化會使其等離子體共振效應發生改變，金屬納米粒子的顏色隨之改變并產生強烈的光散射信號[9-11]。據此，可將利用藥物分子誘導納米金顆粒聚集所建立的光散射分析法用于藥物小分子的測定。共振光散射光譜法具有快速、簡便、靈敏等特點，已廣泛應用于痕量無機物和有機物的分析[12-15]，而將納米金等離子體共振光散射分析法用于阿米卡星的檢測目前尚未見報道。本研究發現，在適宜pH值條件的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中，阿米卡星可誘導納米金顆粒聚集形成更大的金顆粒，產生較強的等離子體共振光散射信號，并據此建立了一種測定阿米卡星的共振光散射光譜分析新方法，用于阿米卡星注射液的檢測，方法簡便、快速，結果比較滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CRT970型熒光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司提供)；UV2100型紫外-可見分光光度計(北京瑞利分析儀器(集團)有限責任公司提供)； H-600 透射電鏡(日本電子株式會社提供)；TP-350S磁力加熱攪拌器(杭州米歐儀器有限公司提供)；MTC-100振蕩型恒溫金屬浴(杭州米歐儀器有限公司提供)；RU-T25超純水儀(上海同田生物技術有限公司提供)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司提供)。

阿米卡星標準品(Sigma公司提供)：4 μg/mL；1.0%(質量分數，下同)HAuCl4(國藥集團上海化學試劑有限公司提供)；1.0%(質量分數，下同)檸檬酸鈉；pH值為2.6～8.0的檸檬酸-Na2HPO4溶液；pH值為4.49～9.18的 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液：取一定量(0.067 mol/L)的KH2PO4溶液，與一定量(0.067 mol/L)的Na2HPO4溶液按一定比例配制；所用試劑均為分析純；實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 實驗方法

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金[16]：取超純水100 mL，放入錐形瓶中，煮沸；加入1.0%的檸檬酸鈉溶液5.00 mL，保持沸騰5 min；快速加入1.0%的HAuCl4溶液1.00 mL，磁力攪拌并持續加熱保持沸騰15 min；冷卻至室溫并定容至100 mL，于4 ℃保存。用透射電鏡觀察制備的納米金顆粒形貌及粒徑大小，發現金顆粒為球形，粒徑約為12 nm，詳見圖1。

圖1 納米金透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy of gold nanoparticles

在1.5 mL的EP管中，依次加入0.10 mL pH值為6.24的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液、一定量的阿米卡星標準溶液、0.60 mL的納米金膠，準確稀釋至1.00 mL，振蕩混勻后反應5 min。用UV2100型紫外-可見分光光度計記錄其吸收光譜。用熒光分光光度計，采用微量石英比色皿，設置λex=λem條件下同步掃描，獲得該體系的共振光散射光譜。在640 nm 波長處測定產物的共振光散射強度I640 mm，并測定其空白值(I640 mm)b，計算ΔI640 mm=I640 mm-(I640 mm)b。

1.3 條件選擇

1.3.1pH值、緩沖溶液用量

實驗考察了pH值為2.6～8.0的檸檬酸-Na2HPO4及pH值為4.49～9.18的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液對體系ΔI640 mm的影響。結果表明：采用檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液，空白值高但ΔI640 mm較小，緩沖溶液的離子強度對納米金顆粒的聚集有明顯的影響；在pH值為5.91～7.17的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中，ΔI640 mm均較為穩定，當pH值為 6.24時，體系的ΔI640 mm最大(見圖2)。故本文選用pH值為6.24的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液，其用量為0.15mL。

圖2 pH值對ΔI640 mm的影響Fig.2 Effect of pH value on ΔI640 mm

1.3.2 納米金膠用量

納米金膠用量對體系ΔI640 mm的影響如圖3所示。結果表明：ΔI640 mm隨納米金膠加入量的增加而相應增大。當納米金膠用量為0.40～0.70mL(ρ(Au)=22.4～40.6μg/mL)時，ΔI640 mm較大。本文選擇0.60 mL納米金膠，即34.8 μg/mL的納米金膠。

圖3 納米金膠用量對ΔI640 mm的影響Fig.3 Effect of colloidal gold on ΔI640 mm

1.3.3 溫度與時間

本文選擇10，20，30，40 ℃體系，考察溫度對體系ΔI640 mm的影響。結果表明：ΔI640 mm在10～40 ℃的恒溫金屬浴條件下均較為穩定，5min后即趨于穩定?？梢?，溫度對該反應體系的影響較小，本文選擇在常溫條件下反應5min后用于測定。

2 結果及討論

納米金顆粒具有表面等離子共振耦合效應，相比分散的膠體金顆粒，聚集的納米金顆?？僧a生較強的散射光信號[17]。阿米卡星為氨基糖苷類抗生素，在適宜的pH值條件下，阿米卡星的氨基與檸檬酸鈉還原法制備的納米金顆粒可因靜電作用結合[18]，導致納米金顆粒發生聚集，使共振光散射信號增強。再者，阿米卡星在一定濃度范圍內與散射光強度增強值之間存在良好的線性關系，據此可建立基于納米金等離子體共振光散射測定阿米卡星的新方法。

2.1 吸收光譜

將阿米卡星溶液加入納米金膠中，隨著阿米卡星加入量的增加，反應產物溶液的顏色由酒紅色逐漸轉變為深紫色，對于質量濃度為0，100，200，400 ng/mL的阿米卡星，最強的吸收峰位置分別為521，532，539，553 nm。反應產物最強吸收峰隨阿米卡星質量濃度的增大出現了紅移(見圖4)。有研究報道，納米金微粒的吸收峰隨其粒徑增大而紅移[19]，據此表明阿米卡星能夠誘導納米金顆粒發生聚集，形成粒徑更大的顆粒。

a—pH值為6.24的 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液-33.6 μg/mL納米金膠-0 ng/mL阿米卡星；b—pH值為6.24的 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液-33.6 μg/mL納米金膠-100 ng/mL阿米卡星；c—pH值為6.24 的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液-33.6 μg/mL納米金膠-200 ng/mL阿米卡星；d—pH值為6.24 的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液-33.6 μg/mL納米金膠-400 ng/mL阿米卡星。圖4 納米金與阿米卡星體系吸收光譜圖Fig.4 Absorption spectra of Amikacin with gold nanoparticles

2.2 共振光散射光譜

阿米卡星的共振光散射信號很弱。納米金膠溶液在620 nm和640 nm處存在較為明顯的共振光散射峰。納米金膠溶液中加入阿米卡星后，在470，620，640 nm處均出現了明顯的散射峰，散射峰的強度顯著增強，亦表明阿米卡星能誘導納米金發生明顯聚集。本研究選擇測定了640 nm的共振光散射強度，見圖5。

a—400 ng/mL阿米卡星；b—pH值為6.24 的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液-33.6 μg/mL納米金膠-0 ng/mL阿米卡星；c—pH值為6.24的 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液-33.6 μg/mL納米金膠-100 ng/mL阿米卡星；d—pH值為6.24的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液-33.6 μg/mL納米金膠-200 ng/mL阿米卡星；e—pH值為6.24的 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液-33.6 μg/mL納米金膠-400 ng/mL阿米卡星。圖5 納米金與阿米卡星體系共振光散射光譜圖Fig.5 Resonance light scattering spectra of Amikacin with gold nanoparticles

2.3 工作曲線

按實驗方法確定最佳實驗條件，測定不同質量濃度阿米卡星對應的共振光散射強度ΔI640 mm。以阿米卡星質量濃度ρ對ΔI640 mm作圖，阿米卡星在1.5～500 ng/mL范圍內與ΔI640 mm之間存在良好的線性關系?；貧w方程為ΔI640 mm=1.97ρ+16.31(n=7，R2=0.995 4)，檢出限為0.52 ng/mL。表明本方法簡便快速，靈敏度高。

2.4 共存物質的影響

按實驗方法，考察了共存物質對測定200 ng/mL 阿米卡星的干擾情況，控制相對誤差為±5%。結果表明：常見的金屬離子(如Na+，K+，Ca2+，Zn2+)，非金屬離子(如F-，Br-，I-)及葡萄糖、蔗糖等均不干擾測定，故該方法具有較好的選擇性。

2.5 樣品分析

取市售不同廠家阿米卡星注射液5 μL，放入25 mL容量瓶中，稀釋至刻度。準確移取20 μL，按實驗方法測定，并與高效液相色譜法進行比較[20]，結果見表1。由表1可以看出，實驗結果與廠家標示值一致，表明數據可靠。

表1 阿米卡星注射液測定結果

針對不同廠家的阿米卡星注射液，加入一定量的阿米卡星標準品，采用標準加入法測定其回收率，測得回收率為96.5 %～107.5 %(見表2)，結果滿意。實驗表明，該方法可用于準確測定阿米卡星注射液中阿米卡星的含量。

表2 阿米卡星注射液回收率測定

3 結 語

通過對納米金膠和阿米卡星反應體系的吸收光譜和共振光散射光譜分析可知，阿米卡星可誘導納米金顆粒聚集，聚集的納米金顆粒因表面等離子體的耦合，在640 nm處可產生很強的共振光散射信號，該散射信號的增強值與阿米卡星的質量濃度呈現良好的線性關系。該方法已用于市售阿米卡星注射液的測定，并完成了樣本的回收實驗，結果均較滿意。因此，依據阿米卡星對納米金顆粒的誘導聚集作用，基于納米金顆粒表面等離子體效應的改變所建立的檢測方法，可簡便、快速地對阿米卡星的注射液進行檢測。

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Plasmon resonance light scattering spectral assay of Amikacin based on gold nanoparticles

ZOU Mingjing1， WANG Na2

(1.Central Laboratory, Heze Medical College， Heze， Shandong 274030, China；2.Shangqiu Medical College， Shangqiu， Henan 476000， China)

In order to conveniently and fastly test Amikacin injection，a new method for detection of Amikacin is established based on the plasmon resonance effect of gold nanoparticles. In KH2PO4-Na2HPO4buffer with proper pH value, the resonance light scattering intensity at 640 nm is enhanced greatly due to the interaction of gold nanoparticles and amikacin, and ΔI640 nmis linear proportional to the concentration of Amikacin in the range of 1.5～500 ng/mL, and the detection limit is 0.52 ng/mL. Under certain experiment condition, gold nanoparticles are aggregated induced by Amikacin, and the distance variation makes its plasmonic resonance effect change greatly. The aggregated nanoparticles surface plasmon coupling produces strong resonance light scattering signal, and the resonance light scattering signal shows a good linear relationship with the concentration of Amikacin. The experiment shows that the method can be used to detect Amikacin rapidly.

spectroanalysis； gold nanoparticles； Amikacin； plasmonic effect； resonance light scattering

1008-1534(2017)01-0018-05

2016-11-04;

2016-12-08；責任編輯：張士瑩

山東省高等學?？萍加媱濏椖?J11LB01)；菏澤醫學?？茖W校科研項目(H14k05)

鄒明靜(1982—)，女，重慶梁平人，講師，碩士，主要從事分子光譜分析方面的研究。

E-mail：mingjingzou@126.com

O656.3

A

10.7535/hbgykj.2017yx01004

鄒明靜，王 娜.基于納米金等離子體共振光散射法測定阿米卡星[J].河北工業科技,2017,34(1):18-22. ZOU Mingjing，WANG Na.Plasmon resonance light scattering spectral assay of Amikacin based on gold nanoparticles[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology,2017,34(1):18-22.