大烏泡根總黃酮提取工藝優(yōu)選*

孟 鑫， 劉 瑤， 陳 瑞， 蔡 進， 毛政益， 劉珈伲， 劉麗娜， 黃 靜*

(貴州醫(yī)科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025)

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大烏泡根總黃酮提取工藝優(yōu)選*

孟 鑫**， 劉 瑤， 陳 瑞， 蔡 進， 毛政益， 劉珈伲， 劉麗娜， 黃 靜***

(貴州醫(yī)科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025)

目的： 考察大烏泡根總黃酮的提取工藝。方法： 選取料液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度為考察因素，以總黃酮得率為評價指標，采用正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，并用紫外分光光度法對大烏泡根總黃酮含量進行測定。結(jié)果： 大烏泡根總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為料液比為1∶10，乙醇溶液體積分數(shù)為60%，提取時間為2 h，提取溫度為70 ℃；該條件下測定大烏泡根總黃酮含量為4.8%。結(jié)論： 大烏泡根總黃酮含量的測定方法簡便，準確可靠，為大烏泡藥材質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。

中草藥； 植物提取物； 大烏泡； 總黃酮； 正交試驗

大烏泡為薔薇科懸鉤子屬(RubusmultibroacteatusLevl&Vant．)，以根及全株入藥，性苦、涼，入脾、肝二經(jīng)，全國大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于四川、云南、貴州等地，具清熱解毒、祛風除濕、涼血、止血，接骨的功效，多用于治痢疾、腹瀉、風濕痹痛、咳血、婦女倒經(jīng)，骨折等[1-3]。目前，大烏泡已是上市中藥制劑齲齒寧中的一味重要藥材，用來治療齲齒痛，牙周炎，牙齦炎[4]。大烏泡為苗藥的常用藥，曾有其總黃酮的含量測定[5]及大烏泡抗炎活性篩選[6]的報道，并從大烏泡正丁醇部位中分離出4個黃酮類化合物[7]，黃酮類成分作為中草藥重要的活性物質(zhì)，具有抗氧化，抗炎，抗菌、抗病毒、保護心血管系統(tǒng)等方面的療效[8-10]。目前尚未見對其根部總黃酮提取工藝條件研究的報道，本研究對大烏泡根總黃酮進行提取，通過正交實驗方法對提取工藝進行探討，同時對其總黃酮含量進行測定，為臨床應(yīng)用和產(chǎn)地加工提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大烏泡 藥材于2013年6月采自貴州凱里市，各試驗樣本由貴州醫(yī)科大學中藥學教研室龍慶德副教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬大烏泡(RubusmultibroacteatusLevl&Vant．)的干燥根。

1.1.2 儀器與試劑 UV-1750紫外分光光度計(島津儀器有限公司), DFT-200手提式高速中藥粉碎機(溫嶺市大得中藥機械有限公司),EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司),SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司),SEF-OBR型回旋蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司),D2F-OB型真空干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司),蘆丁標準品(中國食品藥品鑒定所，批號100080-200707)，其他試劑均為分析純。

1.2 大烏泡根總黃酮含量測定

1.2.1 供試品溶液的制備 取大烏泡根莖適量，用手提式高速中藥粉碎機粉碎成粉末，稱定3.0 g，回流提取,減壓濃縮(60 ℃)并定容至50 mL容量瓶中，得供試品溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備 根據(jù)文獻[11-12]和前期試驗發(fā)現(xiàn)大烏泡根中含有黃酮類成分蘆丁，故采用蘆丁為標準品測定其所含黃酮類成分的含量。精密稱取蘆丁對照品10 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入60%的乙醇溶解，定容至刻度，搖勻靜置，即得蘆丁對照品溶液。

1.2.3 測定波長的選擇 稱取蘆丁對照品2 mg，置于10 mL容量瓶中，制成0.2 g/L的蘆丁標準品溶液，之后采用加NaNO2-Al(NO3)3-NaOH染色法測定其最大波長，以相應(yīng)試劑為空白，在400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描以確定最大吸收波長。吸取樣品溶液0.5 mL，同樣采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定大烏泡根中總黃酮吸收波長。最終結(jié)果顯示蘆丁與大烏泡根中總黃酮的最大吸收波長均為512 nm，其他成分對測定無干擾，故選擇512 nm為最終大烏泡根總黃酮測定波長。

1.2.4 線性關(guān)系的考察 分別吸取上述蘆丁標準溶液0.0、0.25、0.5、1.0、1.5及2.0 mL于6只10 mL的容量瓶中，先加入5 %亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；然后加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，用60 %的乙醇稀釋至10 mL，搖勻，放置10～15 min后，在512 nm波長處測定吸光度A。以蘆丁溶液濃度C(mg/mL)為橫坐標，分光光度法測定的吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3 方法學考察

1.3.1 精密度試驗 精密吸取一定量標準品溶液，按“1.2.4項”同法操作，測定其吸光度值，并重復測定6次。

1.3.2 重復性試驗 精密吸取一定量某一供試品溶液6份，按“1.2.4項”方法進行顯色和測定，測定其吸光度。

1.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取一定量同一供試品溶液，按“1.2.4項”方法進行顯色和測定，分別在15、30、45、60、90及150 min測定其吸光度。

1.3.4 加樣回收率試驗 精密稱取蘆丁對照品適量，加入已知含量的樣品，稱取樣品6份，每份約30 mg，精密稱定，按供試品溶液制備方法制成溶液6份，精密吸取供一定量供試品溶液，按“1.2.4項”方法測定總黃酮，計算其回收率。

1.4 正交試驗優(yōu)選提取工藝

根據(jù)文獻報道[13-14]及大生產(chǎn)實際情況，影響黃酮提取效率的主要因素為提取溶劑的種類、濃度、提取溫度與提取次數(shù)。依據(jù)黃酮的理化性質(zhì)，選擇影響提取的主要因素料液比、乙醇溶液體積分數(shù)、提取時間、 提取溫度4個因素，每個因素選取3個水平，采用L9(34)正交試驗，以總黃酮含量為考察指標。每個試驗重復3次進行，正交試驗因素水平見表1。

表1 大烏泡根總黃酮提取的因素及水平Tab.1 Factors and levels of flavonoids extraction in Rubus multibracteatus Levl & Vant．

1.5 樣品黃酮含量

吸取供試品溶液0.2 mL，置于10 mL容量瓶中，參照“1.2.4項下”于512 nm處測定總黃酮。計算大烏泡根總黃酮含量(mg/g)=(C×V×N)/W。C為測量液總黃酮濃度(mg/mL)，N為稀釋倍數(shù)，V為粗提液體積(mL)，W為藥材干重(g)。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

以蘆丁溶液濃度C(mg/mL)為橫坐標，分光光度法測定的吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=0.011×C-0.009,R2=0.999，表明蘆丁對照品溶液濃度為10.9～87.2 g/L ，呈良好的線性關(guān)系。

2.2 方法學考察

精密度試驗中，測定其吸光度值為0.405、0.403、0.416、0.394、0.395、0.401，相對標準偏差(RSD)為1.41%，表明儀器精密度良好。重復性試驗中，其樣品含量為4.68%、4.82%、4.78%、4.75%、4.60%、4.79%，相對標準偏差(RSD)為1.33%，表明試驗重復性好。穩(wěn)定性試驗中，在15、30、45、60、90、150 min的吸光度值為0.405、0.403、0.416、0.394、0.495、0.401，相對標準偏差(RSD)值為1.41%，表明供試品在150 min內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收率實驗結(jié)果見表2，平均加樣回收率為99.22%，RSD值為1.02%，表明準確度符合試驗要求。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 The results of spotting recovery

2.3 正交試驗結(jié)果及樣品黃酮含量

對正交試驗設(shè)計表中的9個試驗都分別進行3次的平行試驗，并對試驗提取所得的27份提取液中的總黃酮進行測定，見表3和表4。

表3 正交試驗結(jié)果Tab.3 The results of orthogonal text

表4 正交試驗方差分析Tab.4 ANOVA of orthogonal experiment

注：F0.05(2,18)=3.55 ，F(xiàn)0.01(2,18)=6.01(1)表示差異非常顯著,F>F0.01(2,18)

結(jié)果表明，提取時間是影響提取條件的最主要因素，料液比影響次之，由直觀分析確定并綜合經(jīng)濟性和實驗室條件等各因素考慮，最終確定最優(yōu)方案為用料液比為1∶10，乙醇溶液體積分數(shù)為60%，提取時間為2 h，提取溫度為70 ℃。并計算大烏泡根中總黃酮含量為4.8%。

3 討論

正交試驗法在研究藥材有效部位提取工藝中有廣泛應(yīng)用，正交試驗可以在最短時間，最節(jié)約成本的前提下簡便有效的測定出藥用植物的最佳提取工藝。本課題亦選用正交試驗法對大烏泡根總黃酮的乙醇提取工藝進行篩選，以大烏泡根中總黃酮含量為指標對其乙醇加熱回流提取工藝進行了篩選，實驗結(jié)果顯示大烏泡根總黃酮的最佳提取工藝為用料液比為1∶10，乙醇溶液體積分數(shù)為60%，提取時間為2 h，提取溫度為70 ℃。大烏泡作為貴州苗族地區(qū)的常用藥，但并沒有被中國藥典收錄，本試驗對大烏泡根中總黃酮的提取方法進行了考察并驗證了其方法的可靠性，為大烏泡產(chǎn)地的種植及藥用價值的開發(fā)提供依據(jù)，并為今后大烏泡質(zhì)量標準的建立奠定了基礎(chǔ)。

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(2016-09-13收稿，2016-11-26修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

Technology Optimization for Extracting Total Flavonoids from the Root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant．

MENG Xin, LIU Yao, CHEN Rui, CAI Jin, MAO Zhengyi, LIU Jiani, LIU Lina, HUANG Jing

(CollegeofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

Objective: To explore the extraction process of total flavonoids in the root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant. Methods: The solid-liquid ratio, ethanol concentration, extraction time, extraction temperature were selected as factors and the yield of total flavonoids as evaluation index. The extraction process was optimized by orthogonal test, and the content of total flavonoids in the root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant was determined by UV spectrophotometry. Results: The optimum parameters of extraction process of total flavonoids from the root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant was a follow: solid-liquid ratio 1∶10, ethanol volume fraction 60%, extraction time 2 h, extraction temperature 70 ℃. Under above condition, the content of total flavonoids from the root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant was 4.8%. Conclusion: The method is practical, accurate and reliable, and can be used as quality control method ofRubusmultibracteatusLevl & Vant.

drug,Chinese herbal; plants extracts;RubusmultibracteatusLevl & Vant.; total flavonoids; orthogonal experiment

貴州省科技廳中藥攻關(guān)項目[黔科合ZY(2011)3005]

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.001.html

R285.1

A

1000-2707(2016)12-1411-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.010

**貴州醫(yī)科大學2012級碩士研究生

***通信作者 E-mail:huangjgy@sohu.com