黃芩素減輕柔紅霉素誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷*

白小強， 王新蘭， 韓小東,2**, 黃勇攀

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 陜西 延安 716000； 2.西安交通大學(xué) 第二附屬醫(yī)院, 陜西 西安 710049； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥理學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550004； 4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院, 湖南 長沙 410078)

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黃芩素減輕柔紅霉素誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷*

白小強1， 王新蘭1， 韓小東1,2**, 黃勇攀3,4

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 陜西 延安 716000； 2.西安交通大學(xué) 第二附屬醫(yī)院, 陜西 西安 710049； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥理學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550004； 4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院, 湖南 長沙 410078)

目的： 探討黃芩素(Bai)對柔紅霉素(Dox)致小鼠心肌損傷的保護作用，闡明其抗柔紅霉素誘導(dǎo)的心肌損傷機制。方法： 80只小鼠隨機分為5組(n=16)：對照組、Dox模型組和Bai高、中、低劑量組(40、20、10 mg/kg),腹腔注射柔紅霉素(20 mg/kg)制備小鼠心臟毒性模型，檢測心肌ALT、AST、CK、LDH、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽還原酶(GSH)水平，電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果： 心電圖顯示，Dox可導(dǎo)致小鼠心律失常；模型組小鼠心肌酶ALT、AST、CK、LDH水平顯著升高，Bai高、中、低劑量組呈劑量依賴下降；模型組小鼠心肌SOD、CAT、GSH活性顯著下降，MDA含量增多，Bai高、中、低劑量組呈濃度依賴升高，MDA含量降低；電鏡顯示Dox組小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，心肌細胞腫脹，部分肌絲排列紊亂，斷裂溶解，線粒體明顯腫脹，線粒體嵴斷裂消失；Bai高、中、低劑量組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)呈不同程度改善。結(jié)論： Bai對Dox致小鼠心肌損傷具有保護作用，其機制可能與其抗氧化活性有關(guān)。

黃芩素； 柔紅霉素； 心臟毒性； 心肌酶

柔紅霉素(doxorubicin，Dox)是臨床上最為常用的蒽環(huán)類化療藥物之一，其抗腫瘤活性廣泛，但由于該藥物的心臟毒性限制了其在臨床上的應(yīng)用[1-3]，Dox心臟毒性自由基損傷被大多數(shù)研究者所接受。Dox能引起心肌細胞在代謝過程中產(chǎn)生活性氧(reaetive oxygen species，ROS)，過量的ROS攻擊心肌細胞，增加心肌細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和降低心肌細胞內(nèi)抗氧化物酶的活性，使心肌細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而引起心肌病和充血性心力衰竭。黃芩素(baicalein，Bai)是從中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，具有較強的抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化及清除氧自由基等廣泛藥理作用[4-5]，本研究通過建立Dox致小鼠心肌損傷模型，探討B(tài)ai對心肌損害的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠80只，SPF級，雌雄各半，體重(20±2)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號2004A062。

1.1.2 藥物與試劑 柔紅霉素購自延安大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，黃芩素(純度98%)購自Sigma公司。臨用前配制成40 mg/L的溶液。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶 MB同工酶(CK-MB)、SOD、MDA、CAT測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 酶標儀購自Thermo公司，電動勻漿儀購自德國，H-7650型透射電鏡購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心臟毒性模型制備 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，檢測心電圖。隨機將心電圖正常小鼠隨機分為如下5組：正常對照組(control組)、模型組 (Dox組)、黃芩素高劑量組(Dox+Bai 40 mg/L)、黃芩素中劑量組(Dox+Bai 20 mg/L)及黃芩素低劑量組(Dox+Bai 10 mg/L)，連續(xù)給藥兩周。除正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水外，其余各給藥組小鼠均每3 d通過腹腔注射給予Dox(累積劑量20 mg/kg)，制備Dox心臟毒性模型，模型成功與否采用心電圖來檢測。各給藥組動物于次日開始給予不同劑量黃芩素。1.2.2 心電圖觀察 Dox組，黃芩素高劑量組(40 mg/L)，黃芩素中劑量組(20 mg/L)，黃芩素低劑量組(10 mg/L)注射柔紅霉素，對照組腹腔注射同體積的生理鹽水12 h后，小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定，采用標準肢體Ⅱ?qū)?lián)描記心電圖，觀察心律失常的發(fā)生率。以出現(xiàn)各種類型的期前收縮、房室傳導(dǎo)阻滯、竇性心動過速、竇性心動過緩中的任何一項都視為心律失常。

1.2.3 標本收集 給藥兩周后，采用頸椎脫臼處死動物，取出心臟用預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重冰浴中取部分心室，用生理鹽水制成 10%心肌組織勻漿，4 ℃，3 000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，取上清檢測心肌ALT、AST、CK-MB、LDH、SOD、MDA、CAT等指標，前述檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2.4 病理組織學(xué)檢查 采用水合氯醛(5%，1 mL/kg)深度麻醉小鼠后，剪開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室插入灌注針頭，穿入主動脈內(nèi)，同時剪開右心耳，快速灌注生理鹽水約 20 mL，然后接換4 ℃ 4%多聚甲醛30 mL繼續(xù)灌注，直至小鼠四肢強直、發(fā)白。此時固定完畢，開顱取腦，4%多聚甲醛固定24 h，制作石蠟切片，然后蘇木精-伊紅染色。

1.2.5 電鏡觀察 取實驗動物心肌組織，1 mm×1 mm×1 mm，戊二醛(2.5%)和鋨酸(1%)雙重固定，丙酮脫水，樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾(1%)及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般指標

對照組小鼠在實驗期間飲水、進食、運動正常，體重穩(wěn)定增加。給予Dox后，從實驗第2、3天開始，實驗動物活動少及進食減少、體重不增等；實驗第5天開始出現(xiàn)腹水；隨著實驗時間的延長，上述現(xiàn)象更明顯；第10天，Dox組有3只死于充血性心衰 (CHF)，尸檢發(fā)現(xiàn)胸腹腔積液、肝腫大、心腔擴大、心室壁明顯變薄等表現(xiàn)。各給藥組動物也出現(xiàn)飲食差、活動少等表現(xiàn)；但給藥后各給藥組動物體重均有不同程度的增長，胸腹腔積液減輕，未見明顯肝腫大、心腔擴大等表現(xiàn)。各給藥組心律失常的發(fā)生率均降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

表1 Bai對Dox誘導(dǎo)小鼠心電圖的影響Tab.1 Effects of Bai on electrocardiogram in Dox-induced cardiotoxic mice

(1)與對照組比較，P<0.05;(2)與Dox組比較,P<0.05

2.2 Bai對小鼠心肌酶AST、ALT、LDH和CK-MB含量的影響

AST、ALT、LDH和CK水平升高提示心肌損傷，可作為臨床診斷心肌組織損傷的評價指標。與正常對照組比較，Dox組小鼠心肌AST、ALT、LDH和CK-MB水平均顯著升高(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)差異。與Dox組比較，各給藥組小鼠AST、ALT、LDH和CK-MB水平含量降低，呈劑量依賴，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A、B、C、D。

與對照組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01;與Dox組比較,(3)P<0.05,(4)P<0.01圖1 Bai對Dox誘導(dǎo)小鼠心肌組織AST、ALT、LDH和CK-MB含量的影響Fig.1 Effects of Baicalin on the contents of CK-MB, ALT, LDH and AST in myocardial tissue of mice

2.3 Bai對小鼠心肌組織MDA、SOD、GSH和CAT的影響

與對照組比較，Dox組小鼠心肌組織MDA含量明顯升高，SOD、CAT和GSH活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與Dox組比較，各給藥組小鼠MDA含量呈劑量依賴地降低，SOD、CAT和GSH活性增高，見圖2A、B、C、D。

與對照組比較, (1)P<0.05; 與Dox組比較, (2)P<0.05圖2 Bai對Dox誘導(dǎo)小鼠心肌組織MDA、SOD、CAT和GSH的影響Fig.2 Effects of Bai on content of MDA and activities of SOD, CAT, GSH in myocardial tissue in Dox-induced cardiotoxic mice

2.4 Bai對小鼠心肌細胞形態(tài)學(xué)的影響

對照組小鼠心肌組織HE染色顯示，心肌細胞排列整齊，纖維無破壞，細胞間隙正常，未見水腫。與對照組比較，Dox組小鼠心肌細胞多灶性變性和壞死，表現(xiàn)為心肌纖維丟失，肌漿溶解，間質(zhì)和心肌細胞內(nèi)空泡形成；壞死灶內(nèi)可見單核、淋巴細胞浸潤。各給藥組：較模型組心肌損傷明顯減輕，部分組織與正常大鼠心臟組織學(xué)無明顯差異(圖3)。

注：A為對照組，B為模型組，C為Bai高劑量組，D為Bai中劑量組，E為Bai低劑量組圖3 Bai對Dox誘導(dǎo)小鼠心肌細胞形態(tài)學(xué)的影響(×200)Fig.3 Effects of Bai on myocardial tissue ultrastructure in DOX-induced cardiotoxic mice

2.5 Bai對小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

Dox引起心肌組織氧自由基損傷，其主要是心肌細胞器線粒體腫脹及空泡變性。Dox組心肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，心肌細胞腫脹，部分肌絲排列紊亂，斷裂溶解，線粒體明顯腫脹，線粒體嵴斷裂消失。而Bai高、中、低劑量組心肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯改善，線粒體水腫減輕，空泡樣變性減少，少數(shù)心肌組織肌絲斷裂，損傷較Dox組明顯減輕，而且Bai高劑量組改善最為明顯，心肌纖維結(jié)構(gòu)基本趨于正常(圖4)。

注：A為對照組，B為模型組，C為高劑量組，D為中劑量組，E為低劑量組圖4 Bai對Dox誘導(dǎo)小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響(×50 000)Fig.4 Effects of Bai on myocardial ultrastructure in DOX-induced cardiotoxic mice

3 討論

Dox作為一種重要的蒽環(huán)類抗癌藥物，在高效抗腫瘤的同時，對正常細胞也有損傷作用，尤其體現(xiàn)在對心肌組織的毒性[6]。大量文獻認為，Dox引發(fā)心肌毒性的機制有多種學(xué)說，其中氧自由基損傷機制為多數(shù)學(xué)者所支持。Dox與心肌細胞具有獨特的親和力，極易在心臟中蓄積，當Dox進入心肌細胞后，導(dǎo)致線粒體內(nèi)呼吸鏈功能異常，大量的ROS產(chǎn)生，ROS進而攻擊心肌細胞，引起心肌細胞氧化損傷。心肌細胞膜受損后，細胞膜通透性增大，造成胞內(nèi)多種酶外漏，如ALT、AST、LDH等，嚴重影響心肌纖維的舒縮功能。因此，心肌細胞損傷的心肌酶譜生化指標ALT、AST、LDH、CK、CK-MB可以用來評價Dox致心肌損傷的嚴重程度。

本研究通過腹腔注射Dox致小鼠心肌損傷模型，分4次給完，Dox累計劑量為20 mg/kg，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠體重減輕明顯，心律失常發(fā)生率高達70%，心肌組織勻漿心肌酶ALT、AST、LDH、CK水平顯著升高。不同濃度Bai降低ALT、AST、LDH、CK水平，呈劑量依賴，從而減輕心肌損傷。

MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，常用來反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。正常情況下SOD、CAT和GSH在構(gòu)成了細胞內(nèi)在的抗氧化防御系統(tǒng)，其活性高低反映機體清除氧自由基的能力。Dox抑制心肌細胞SOD和CAT等抗氧化酶的活性[7-8]。本研究顯示Dox致小鼠心肌組織MDA含量升高，SOD、CAT和GSH活性降低，心肌超微結(jié)構(gòu)改變明顯，如線粒體腫脹明顯及空泡變性、肌絲斷裂、線粒體嵴斷裂。Bai明顯降低心肌組織MDA含量，提高SOD、CAT和GSH活性。電鏡下觀察，可見心肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯改善，線粒體水腫程度減輕，空泡樣變性減少。Bai作為一種天然黃酮類化合物，其具有清除自由基及較強的抗氧化能力，通常用于心腦血管疾病的防治[9]。本研究顯示Bai對Dox致小鼠心肌損傷后氧化與抗氧化系統(tǒng)的保護作用，其機制可能與提高心肌抗氧化酶活性和清除自由基有關(guān)。

研究表明，Dox引起心肌組織損傷其機制為氧化應(yīng)激所致氧自由基大量產(chǎn)生，影響了細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致心肌細胞亞細胞結(jié)構(gòu)變化，包括心肌細胞支架結(jié)構(gòu)完整性的喪失，線粒體腫脹等[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Bai可以改善心肌超微結(jié)構(gòu)損傷。綜上所述，Bai能減輕Dox致心肌氧自由基損傷，從而降低其心臟毒性。

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(2016-09-15收稿，2016-11-26修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

Amelioration of Doxorubicin-induced Myocardial Injury in Mice by Baicalein

BAI Xiaoqiang1, WANG Xinlan1, HAN Xiaodong1,2, HUANG Yongpan3，4

(1.MedicalCollege,YananUniversity,Yanan716000,Shaanxi,China; 2.theSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710049,Shaanxi,China; 3.DepartmentofPharmacology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004Guizhou,China; 4.XiangyaMedicalCollege,CentralSouthUniversity,Changsha410078,Hunan,China)

Objective: To investigate the protective effect of Baicalein(Bai) on the myocardial injury induced by Doxorubicin(Dox) in mice, and to elucidate the mechanism of myocardial injury induced by Dox. Methods: 80 mice were randomly divided into five groups (n=16): control group, Dox model group, high, medium and low Bai dose group (40,20,10 mg/kg). Intraperitoneal injection of Dox (20 mg/kg) was adopted to establish mouse cardiac toxicity model. Myocardial ALT, AST, CK, LDH, superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), glutathione reductase (GSH) level were detected, and electron microscope was used to observe the changes of myocardial tissue ultrastructure. Results: ECG showed that DOX could lead to mice arrhythmia. In model group of mice, myocardial enzyme such as ALT, AST, CK, LDH levels were significantly elevated,while in high, medium and low Bai dose group the myocardial enzyme activities showed a dose-dependent decline. In the model group, SOD, CAT, GSH activity was significantly decreased, while MDA content increased. In high, medium and low Bai dose group SOD, CAT, GSH activity showed a concentration-dependent increase, while MDA content decreased. Electron microscope showed that the ultrastructure of myocardial tissue in Dox group was obviously damaged, the myocardial cells were swollen, some of the muscle fibers arranged in disorder and were broken to dissolution, the mitochondria was obviously swollen, and the the mitochondrial crest disappeared. In high, medium and low Bai dose group, myocardial tissue ultrastructure improved to different degree. Conclusion: Baicalin can play a protective role on myocardial injury induced by Doxorubicin in mice, and the mechanism may be related to its antioxidant activity.

baicalein; doxorubicin; cardiotoxicity; myocardial enzymes

陜西教育廳科學(xué)研究項目(12JK0755)； 延安市科技惠民項目(2014HM-05)

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.007.html

R965.1

A

1000-2707(2016)12-1430-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.014

**通信作者 E-mail:haorenbudazhe@126.com