花生AhPLDα基因植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

劉義杰，陳四龍，程增書(shū)，王 瑾，宋亞輝，郝軍會(huì)，張朋娟，李玉榮

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035)

花生AhPLDα基因植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建
及對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

劉義杰，陳四龍，程增書(shū)，王 瑾，宋亞輝，郝軍會(huì)，張朋娟，李玉榮

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035)

為了明確花生AhPLDα基因在響應(yīng)干旱脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中的功能和作用機(jī)制，以ABA處理的冀花4號(hào)花生葉片cDNA為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增AhPLDα1和AhPLDα2的全長(zhǎng)CDS片段，采用酶切-連接的方法分別將這2個(gè)基因定向克隆到植物表達(dá)載體pBar-F3上，凍融法將重組子轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，利用改良Floral-dip法將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥。菌落PCR和酶切結(jié)果表明，CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)表達(dá)載體重組質(zhì)粒pBar-AhPLDα構(gòu)建正確。通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR驗(yàn)證，表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到擬南芥基因組中并能過(guò)量表達(dá)，獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因純合株系。干旱脅迫試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性較野生型明顯增強(qiáng)。可見(jiàn)，AhPLDα基因參與了干旱脅迫應(yīng)答過(guò)程，是轉(zhuǎn)基因途徑提高作物耐旱性的潛在候選基因。

花生；AhPLDα基因；植物表達(dá)載體；轉(zhuǎn)基因；干旱脅迫信號(hào)

花生(ArachishypogaeaL.)是一種重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)花生年均種植面積450萬(wàn)hm2以上，總產(chǎn)居世界首位，花生油年產(chǎn)量占國(guó)產(chǎn)植物油總量的23%[1-2]。目前國(guó)內(nèi)食用油過(guò)度依賴(lài)進(jìn)口，油脂供給安全問(wèn)題凸顯，花生在保障我國(guó)食用油供給安全、穩(wěn)定國(guó)內(nèi)油源方面，具有較大的潛力和優(yōu)勢(shì)。然而，在我國(guó)花生主產(chǎn)區(qū)，干旱[3]、鹽漬、低溫、病害等已成為花生產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)一步提高的重要制約因素，嚴(yán)重阻礙了花生生產(chǎn)水平進(jìn)一步提高和種植面積進(jìn)一步擴(kuò)大。我國(guó)花生集中種植在干旱半干旱的內(nèi)陸及丘陵地區(qū)，70%以上受干旱威脅，每年因干旱減產(chǎn)達(dá)30%～50%，并導(dǎo)致花生品質(zhì)劣變，油脂含量和品質(zhì)下降，黃曲霉毒素污染加重[4-5]，給消費(fèi)者的健康帶來(lái)巨大威脅。因此，花生品種抗旱改良已成為我國(guó)花生育種的重要目標(biāo)之一。常規(guī)育種技術(shù)在培育、創(chuàng)制耐旱性花生品種和種質(zhì)方面發(fā)揮了重要作用，但是，近年來(lái)隨著作物功能基因組學(xué)的發(fā)展，基因工程技術(shù)定向培育抗性?xún)?yōu)良的新品種成為提高作物抗旱耐逆性的新途徑。經(jīng)過(guò)多年努力，目前研究者克隆了幾個(gè)花生抗旱相關(guān)的功能基因，但是具有明顯生物學(xué)功能的關(guān)鍵基因數(shù)量仍顯不足，且缺乏有效的植物表達(dá)載體，限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高花生抗旱性中的快速應(yīng)用。所以，克隆花生抗旱相關(guān)基因并構(gòu)建植物表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)對(duì)植物受體的遺傳轉(zhuǎn)化，將對(duì)增強(qiáng)花生品種抗旱能力、提高花生產(chǎn)量和品質(zhì)、保障國(guó)家食用植物油安全等具有重要意義。

磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)是一類(lèi)重要的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，可水解磷脂，產(chǎn)生磷脂酸、三磷酸肌醇、膽堿、乙醇胺和二酰基甘油等信號(hào)分子，參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，因此PLD是一種既具有水解作用又具有信號(hào)傳遞作用的雙重功能酶[6]。PLD編碼基因?qū)儆诙嗷蚣易澹瑪M南芥中已經(jīng)確認(rèn)12個(gè)PLD家族成員，其中包含已鑒定的3個(gè)含C2結(jié)構(gòu)域的PLDα基因[7-8]，相對(duì)于其他PLD成員，PLDα在植物中存在最為廣泛[9]，并在植物生長(zhǎng)與發(fā)育、抗逆及激素反應(yīng)等生理過(guò)程中起重要作用，此外PLDα基因表達(dá)與逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程密切相關(guān)。植物在逆境環(huán)境中，PLDα可導(dǎo)致脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ETH)等與脅迫有關(guān)的植物激素的產(chǎn)生，從而引起植物對(duì)各種生物或非生物脅迫做出一系列生理生化反應(yīng)[10]。大量研究已表明，PLDα參與了ABA誘導(dǎo)的擬南芥植株衰老過(guò)程、ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程[11-12]。Welti等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PLDα基因被反義抑制后，轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫能力較野生型明顯提高。曾正兵等[14]也指出PLDα基因參與擬南芥的低溫馴化過(guò)程，不參與ABA誘導(dǎo)的抗凍性過(guò)程。Sang等[15]發(fā)現(xiàn)擬南芥PLDα基因抑制突變體的抗旱性比野生型顯著降低，且離體葉片失水速率明顯提高，指出PLDα被抑制后，氣孔對(duì)ABA的敏感性降低，所以蒸騰失水速率增加，抗旱性下降。水稻受到白葉枯病原菌侵染時(shí)，在病菌與植物接觸的部位聚集了大量且有活性的PLDα蛋白，抗病品種尤為顯著[16]。擬南芥PLD基因家族在響應(yīng)生物和非生物脅迫中的生物學(xué)功能被揭示以來(lái)，為作物PLD基因功能研究與利用提供了借鑒。PLDα在植物響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，是分子育種提高植物抗性的潛在候選基因。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)大豆[17-18]、蓖麻[19]、豇豆[20]、谷子[21]、小麥[22]、油菜[23]、水稻[24]等作物的PLD基因家族的生物學(xué)功能已開(kāi)展了大量研究。

花生是一種耐旱性強(qiáng)的作物，花生來(lái)源的干旱脅迫相關(guān)基因的克隆和功能研究鮮見(jiàn)報(bào)道，對(duì)于花生PLD基因的生物學(xué)功能更知之甚少。Nakazawa等[25]于2006年從花生中克隆到AhPLD1和AhPLD2的全長(zhǎng)cDNA。之后，Guo等[26]和Dramé等[27]分別對(duì)這2個(gè)基因的序列和干旱誘導(dǎo)差異表達(dá)做了一定的分析，并未明確它們的生物學(xué)功能。本研究依據(jù)已獲得的AhPLD1和AhPLD2全長(zhǎng)cDNA[25]，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異引物，克隆了這2個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，構(gòu)建了由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物過(guò)表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行了初步抗旱性鑒定，為進(jìn)一步揭示基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為分子育種途徑利用AhPLDα基因提高花生等作物的抗旱性提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

哥倫比亞型擬南芥(Arabidopsisthaliana)、花生品種冀花4號(hào)由河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。

pEASY-T1克隆試劑盒和Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。農(nóng)桿菌空菌株GV3101和植物過(guò)表達(dá)載體pBar-F3為本實(shí)驗(yàn)室保存。

植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒等購(gòu)自天根生化科技有限公司。TaqDNA聚合酶購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoR Ⅰ和XbaⅠ購(gòu)自TaKaRa公司。其他化學(xué)藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 花生處理及取樣

選取大小一致的冀花4號(hào)花生種子，75%酒精消毒5 min，滅菌水沖洗3次，于滅菌濾紙上晾干。將干種子播種于營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1的混合基質(zhì)中，在人工氣候室中25 ℃，12 h光照，60%濕度培養(yǎng)。待幼苗出土20 d后，用100 μmol/L的ABA溶液進(jìn)行噴霧直至葉片全部濕潤(rùn)，并分別于0，24，48，72 h采集葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 擬南芥培養(yǎng)及處理

將擬南芥種子均勻播撒在營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1的混合基質(zhì)中，用保鮮膜覆蓋，4 ℃黑暗層積處理2～4 d，轉(zhuǎn)移到人工氣候室中(光周期晝/夜為17 h/7 h，22 ℃恒溫，65%恒濕)培養(yǎng)。待幼苗出土后(5 d左右)去掉保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后移苗。

移苗用基質(zhì)(生長(zhǎng)基質(zhì))也為營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1的混合基質(zhì)，將基質(zhì)分裝入花盆，再將花盆放入有水的塑料盤(pán)中，水通過(guò)花盆底部的小孔滲入，待花盆中基質(zhì)濕透后即可移苗。輕輕用鑷子從育苗基質(zhì)中拉出小苗，再將根輕壓入花盆中，塑料薄膜覆蓋，黑暗培養(yǎng)3 d，之后正常培養(yǎng)。取生長(zhǎng)28 d的幼苗，干旱處理前5 d停止?jié)菜蠓珠_(kāi)放置，干旱處理21 d，觀察幼苗生長(zhǎng)情況。

1.4 DNA及RNA提取

在擬南芥開(kāi)花前，取擬南芥蓮座幼葉組織，在液氮中速凍，-80 ℃保存。采用CTAB法提取葉片DNA，總RNA的提取參照天根生化公司的植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5 基因片段克隆

提取ABA處理的不同時(shí)間段花生葉片的總RNA，參照天根生化公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一條鏈。以得到的cDNA為模板，根據(jù)Nakazawa等[25]從花生中克隆到的AhPLD1和AhPLD2的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)帶有不同酶切位點(diǎn)的特異引物(表1)，分別擴(kuò)增出AhPLDα1和AhPLDα2基因的cDNA全長(zhǎng)。所用反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。20 μL反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足。

利用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接至pEASY-T1載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Blast在線工具與已知序列比對(duì)分析。

表1 引物名稱(chēng)與序列Tab.1 List of primers and sequences

注：上游引物的劃線部分為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)；下游引物的劃線部分為XbaⅠ酶切位點(diǎn)。

Note：The underline of upstream primers isEcoR Ⅰ cutting site；The underline of downstream primers isXbaⅠ cutting site.

1.6 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

以EcoR Ⅰ和XbaⅠ分別雙酶切AhPLDα1和AhPLDα2基因，回收酶切產(chǎn)物后分別與相同酶切的pBar-F3用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定陽(yáng)性克隆，并送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，陽(yáng)性重組子分別命名為pBar-AhPLDα1和pBar-AhPLDα2。

1.7 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

采用凍融法將植物過(guò)表達(dá)重組子導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，挑選驗(yàn)證得陽(yáng)性重組農(nóng)桿菌單菌落，保存。在200 mL LB培養(yǎng)基中(含100 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平)加200 μL保存菌液，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)2 d，取活化菌液1 mL加入200 mL新鮮LB培養(yǎng)基中搖培過(guò)夜，至OD600為1.0～1.5。室溫4 000 r/min離心15 min，棄上清。加入農(nóng)桿菌浸染法培養(yǎng)液重懸，至其OD600≈0.8。浸染法培養(yǎng)液配制為5%蔗糖加0.05% Silwet L77。采用改良的Floral-dip方法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲T0種子，37 ℃干燥，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選與鑒定

將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥種子分別均勻播撒在營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1的混合基質(zhì)中育苗。待幼苗出土約21 d后噴灑30 mg/L草胺膦除草劑Basta，使擬南芥幼苗葉片全部潤(rùn)濕，隔6～7 d后再?lài)娨淮魏Y選，野生型的擬南芥作對(duì)照。選擇綠色的、健壯的幼苗移栽。采集不同轉(zhuǎn)基因苗的葉片和野生型擬南芥的葉片提取DNA，PCR檢測(cè)(所用引物、程序等與基因擴(kuò)增時(shí)一致)再次篩選，單株收獲陽(yáng)性幼苗的種子。T1轉(zhuǎn)基因擬南芥經(jīng)進(jìn)一步抗性篩選，選擇抗感分離比例符合3∶1的株系，單株移苗，單株收種，種子記為T(mén)2。T2抗性篩選不再分離的株系即為純合轉(zhuǎn)基因株系，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

采集純合轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以AtActin7為內(nèi)標(biāo)基因，獲得的cDNA為模板，設(shè)計(jì)基因特異引物(表1)，利用BIO-RAD IQ5.0實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)AhPLDα1和AhPLDα2基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)生物學(xué)樣品重復(fù)3次。按照SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)體系為20 μL，熱啟動(dòng)程序?yàn)?5 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生和擬南芥總RNA提取與檢測(cè)

本試驗(yàn)采用天根生化公司的植物總RNA提取試劑盒提取花生葉片和擬南芥葉片的總RNA，其中28S rRNA條帶的亮度大約為18S rRNA的2倍，說(shuō)明總RNA具有良好的完整性。經(jīng)NARODROP-2000的分光檢測(cè)，OD260/280約為2.0，說(shuō)明RNA的純度滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 目的基因片段的克隆與分析

以ABA處理的花生葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的混合cDNA為模板，分別以帶有酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ和XbaⅠ的AhPLDα1和AhPLDα2的特異引物(表1)擴(kuò)增基因片段，獲得AhPLDα1和AhPLDα2的目的片段(圖1)。將目的片段分別回收后克隆到pEASY-T1載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明，AhPLDα1和AhPLDα2基因序列的編碼區(qū)與NCBI公布的序列一致，AhPLDα1的cDNA序列全長(zhǎng)為2 385 bp，編碼795個(gè)氨基酸；AhPLDα2的cDNA全長(zhǎng)序列為2 424 bp，編碼808個(gè)氨基酸(圖2)。分析結(jié)果表明克隆的片段正確，可用于下一步試驗(yàn)。

M.1 kb Marker；1.AhPLDα1的擴(kuò)增產(chǎn)物；2.AhPLDα2的擴(kuò)增產(chǎn)物。M.1 kb Marker；1.Product of AhPLDα1；2.Product of AhPLDα2.

圖2 AhPLDα1和AhPLDα2的cDNA序列圖譜Fig.2 cDNA sequences of AhPLDα1 and AhPLDα2

2.3 植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

用EcoR Ⅰ和XbaⅠ分別雙酶切AhPLDα1和AhPLDα2基因，以及植物過(guò)表達(dá)載體pBar-F3，回收產(chǎn)物用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化，獲得融合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證(圖3)，能獲得預(yù)期的約2 400 bp的目的片段。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明，AhPLDα1和AhPLDα2均正向插入到CaMV35S啟動(dòng)子的下游，且不存在移碼突變，證明植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功，分別命名為pBar-AhPLDα1和pBar-AhPLDα2(圖4)。

M.1 kb DNA Ladder；1～4依次為pBar-AhPLDα1菌落PCR、質(zhì)粒PCR、酶切、質(zhì)粒；5～8依次為pBar-AhPLDα2菌落PCR、質(zhì)粒PCR、酶切、質(zhì)粒。

M.1 kb DNA Ladder；1-4.Colony PCR，plasmid PCR，restriction endonucleases digestion，plasmid of recombinant plasmid pBar-AhPLDα1；5-8.Colony PCR，plasmid PCR，restriction endonucleases digestion，plasmid of recombinant plasmid，pBar-AhPLDα2.

圖3 pBar-AhPLDα菌落PCR驗(yàn)證和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證
Fig.3 Identification of recombinant plasmid pBar-AhPLDα1 and pBar-AhPLDα2 by colony PCR and restriction endonucleases digestion

圖4 重組植物過(guò)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Schematic diagram of recombinant plant expression vector construct

2.4 純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的獲得及檢測(cè)

利用改良的Floral-dip法遺傳轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得T0轉(zhuǎn)基因種子。Basta除草劑篩選獲得T1陽(yáng)性植株(圖5)，移栽后開(kāi)花前取擬南芥葉片提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖6)，由凝膠電泳圖可看出，圖6-A、C在2 000 bp以上均獲得了目的基因片段大小的特異條帶，表明2個(gè)目的基因已成功整合到擬南芥基因組中。圖6-B、D在500bp的位置能擴(kuò)增出Bar基因的特異條帶，進(jìn)一步說(shuō)明重組植物過(guò)表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化擬南芥。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株qRT-PCR檢測(cè)

為了進(jìn)一步證實(shí)花生AhPLDα1和AhPLDα2基因在擬南芥中是否過(guò)量表達(dá)，提取T2轉(zhuǎn)基因純合株系和野生型擬南芥的葉片總RNA，采用qRT-PCR方法從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證。圖7-A、B分別為AhPLDα1和AhPLDα2基因在擬南芥葉片中的表達(dá)情況，結(jié)果表明目標(biāo)基因在野生型對(duì)照中均無(wú)表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因植株中目的基因均高水平表達(dá)，但不同轉(zhuǎn)基因株系在表達(dá)水平上存在差異。

WT.噴除草劑7 d后的野生型幼苗；1.AhPLDα1轉(zhuǎn)基因植株；2.AhPLDα2轉(zhuǎn)基因植株。WT.Wild type of herbicide spraying after 7 days； 1.AhPLDα1 transformants；2.AhPLDα2 transformants.

A、C圖中M.1 kb DNA Ladder；B、D圖中M.DL2000 DNA Ladder；A、B中1～10.AhPLDα1轉(zhuǎn)基因植株；11.陽(yáng)性對(duì)照；12.陰性對(duì)照；C、D中1～4.AhPLDα2轉(zhuǎn)基因植株；5.陽(yáng)性對(duì)照；6.陰性對(duì)照。

M in A and C.1 kb DNA Ladder；M in B and D.DL2000 DNA Ladder；1-10 in A and B.T1transformants of pBar-AhPLDα1；11.Positive control；12.Negative control；1-4 in C and D.T1transformants of pBar-AhPLDα2；5.Positive control；6.Negative control.

圖6 T1擬南芥抗性植株轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of T1transformants inArabidopsis

圖7 AhPLDα轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析Fig.7 Detection of gene expression in transgenic AhPLDα lines and wild-type Arabidopsis

2.6 轉(zhuǎn)基因植株抗旱性增強(qiáng)

為了解AhPLDα1和AhPLDα2基因過(guò)表達(dá)對(duì)植物抗旱能力的影響，對(duì)正常生長(zhǎng)28 d的擬南芥幼苗進(jìn)行干旱處理，停止?jié)菜?1 d后野生型植株葉片干枯，全部萎蔫死亡，而轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)正常，受干旱脅迫的影響較小，葉片仍然保持綠色(圖8)，說(shuō)明AhPLDα1和AhPLDα2基因過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。

A.干旱處理的AhPLDα1轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株(WT)；B.干旱處理的AhPLDα2轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株(WT)。A.AhPLDα1 transgenic plants and wild-type plants；B.AhPLDα2 transgenic plants and wild-type plants.

3 討論與結(jié)論

有活性的植物PLD酶最早由Hanahan和Chaikoff從胡蘿卜和白菜葉的提取物中發(fā)現(xiàn)[28]。Kansas州立大學(xué)的王學(xué)敏教授首次從蓖麻種子中克隆得到PLD基因的cDNA[28]，此后相繼從擬南芥[29]、水稻[30-31]、玉米[30]、煙草[32]、番茄[33]等8種作物中分離克隆到15個(gè)不同的PLD基因。在花生中，Heller等[34]首次發(fā)現(xiàn)和提取了種子中的PLD酶。Nakazawa等[25]于2006年從花生中克隆到AhPLD1和AhPLD2的全長(zhǎng)cDNA。之后，Guo等[26]和Dramé等[27]分別對(duì)這2個(gè)基因做了一定的研究，但并未明確它們的生物學(xué)功能。因此，本試驗(yàn)在克隆獲得的AhPLDα1和AhPLDα2基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，為后續(xù)基因功能驗(yàn)證提供了良好的材料和技術(shù)支撐。

在眾多的PLD基因中，PLDα在植物中分布最為廣泛，并廣泛參與植物響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程。擬南芥AtPLDα1的缺失體表現(xiàn)為ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉不敏感，抗旱性弱[11-12]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)小麥TaPLDα[22]和谷子SiPLDα[21]均能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性，干旱條件下轉(zhuǎn)基因植株葉片的相對(duì)含水量增加，離子電導(dǎo)率降低，復(fù)水后成活率提高，種子萌發(fā)階段對(duì)選擇壓的敏感性增強(qiáng)，而且植物干旱脅迫響應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平被不同程度地上調(diào)。本試驗(yàn)中，擬南芥中過(guò)表達(dá)AhPLDα1和AhPLDα2基因，轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性明顯增強(qiáng)，充分表明花生來(lái)源的PLDα同源基因在提高植物抗旱性方面發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)基因植株抗旱性反應(yīng)與體內(nèi)干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的生理生化代謝過(guò)程密切相關(guān)，如葉片失水速率、氣孔開(kāi)閉、丙二醛含量、脯氨酸含量等；也與干旱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵基因受AhPLDα1和AhPLDα2調(diào)節(jié)有直接關(guān)系，如RDs、CORs、HISs、RAB18、DREBs、P5CS1、ABIs等脅迫效應(yīng)基因。以上兩方面指標(biāo)需要在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，以進(jìn)一步揭示AhPLDα1和AhPLDα2基因的作用機(jī)制。花生AhPLDα1和AhPLDα2基因在干旱脅迫響應(yīng)中的功能和作用機(jī)制的闡明，將為提高逆境脅迫下花生等油料作物的產(chǎn)量和品質(zhì)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)使用的植物過(guò)表達(dá)載體pBar-F3以Binary vector pCAMBIA-1301為骨架，用Bar基因替換原骨架上的潮霉素抗性基因HYG(Hygromycin phosphotransferase)，可使轉(zhuǎn)基因植株獲得對(duì)除草劑的抗性，以此作為轉(zhuǎn)基因植株的篩選標(biāo)記，方便篩選轉(zhuǎn)基因后代陽(yáng)性植株；在pBar-F3載體上保留有卡那霉素抗性基因Kan，可在細(xì)菌寄主中進(jìn)行抗性篩選；多克隆位點(diǎn)前有CaMV35S啟動(dòng)子。已有的研究結(jié)果表明，擬南芥AtPLDα1缺失會(huì)使植物應(yīng)答干旱脅迫過(guò)程中的氣孔閉合受阻，導(dǎo)致植株抗干旱能力明顯低于野生型[11]。煙草組成型過(guò)表達(dá)AtPLDα1僅在干旱脅迫初期表現(xiàn)較強(qiáng)的耐旱性，后期的抗旱性較野生型明顯降低[19]。本試驗(yàn)構(gòu)建的植物過(guò)表達(dá)載體，pBar-F3的啟動(dòng)子是組成型強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S，在該啟動(dòng)子的控制下，外源基因可不受植株的發(fā)育階段和器官差異的影響，在任何階段和器官中都可穩(wěn)定表達(dá)[35]。本試驗(yàn)T2純合轉(zhuǎn)基因擬南芥的AhPLDα1和AhPLDα2基因均能在葉片中轉(zhuǎn)錄，但是表達(dá)水平上存在一定差異，推測(cè)這可能是由于目標(biāo)基因插入擬南芥基因組的位點(diǎn)不同造成的。有研究指出，CaMV35S啟動(dòng)子可能會(huì)抑制受體植株該類(lèi)型啟動(dòng)子基因的表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響[36-37]。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中還要觀察轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。pBar-F3載體含有Kan和Bar篩選基因，轉(zhuǎn)化受體植物后可獲得具有雙重篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因材料，為后期篩選提供了方便。

克隆獲得了花生AhPLDα1和AhPLDα2的全長(zhǎng)CDS片段，成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體重組質(zhì)粒pBar-AhPLDα1和pBar-AhPLDα2，遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得AhPLDα1和AhPLDα2基因過(guò)表達(dá)的純合轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性較野生型明顯增強(qiáng)，推測(cè)AhPLDα1和AhPLDα2基因與植物的干旱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有密切關(guān)系。

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Vector Construction to Overexpress AhPLDα Genes from Peanut and Genetic Transformation into Arabidopsis thaliana

LIU Yijie，CHEN Silong，CHENG Zengshu，WANG Jin，SONG Yahui，HAO Junhui，ZHANG Pengjuan，LI Yurong

(Cereal and Oil Crops Institute，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Hebei Provincial Laboratory of Crop Genetics and Breeding，Shijiazhuang 050035，China)

This study provides a good foundation for further elucidating the function and mechanism ofAhPLDα1 andAhPLDα2 in responding to drought stress in peanut.The full-length CDS sequences ofAhPLDα1 andAhPLDα2 were cloned from Jihua 4 peanut leaf with ABA treatment using RT-PCR.TheAhPLDα1 andAhPLDα2 gene fragments were inserted into the expression vector pBar-F3 by forward ways.These constructs were transformed intoAgrobacteriumtumefaciensGV3101 by freeze-thawing method and then introduced into wild-typeArabidopsisthalianausing modified floral-dip method.Under the condition of drought，the authors observed phenotypic changes of wild type and transgenic plants.Colony PCR and enzyme digestion results showed that，the plant overexpressing recombinant plasmid pBar-AhPLDαdriven by CaMV35S promoter was successfully constructed.Glyphosate resistance screening，PCR detection and gene expression analysis showed that the positive transgenic plants were obtained.Under water deprivation，overexpression ofAhPLDα1 andAhPLDα2 in transgenicArabidopsisplants resulted in significantly enhanced tolerance to drought stress.In conclusion，AhPLDα1 andAhPLDα2 have a certain relation with drought stress signal transduction in transgenicArabidopsisplants，and are potential candidate genes on the way to modified crop drought resistance.

Peanut；AhPLDαgene；Plant expression vector；Transgene；Drought stress signaling

2016-07-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201239；31301354)；河北省重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(10960122D)；河北省博士基金項(xiàng)目(F14E055610)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(CARS-14)

劉義杰(1988-)，女，河北石家莊人，碩士，主要從事花生分子生物學(xué)研究。

陳四龍(1978-)，男，河北定州人，副研究員，博士，主要從事花生遺傳育種和栽培研究。 李玉榮(1956-)，女，河北淶水人，研究員，主要從事花生遺傳育種和栽培研究。

S332.4；Q78

A

1000-7091(2016)06-0031-08

10.7668/hbnxb.2016.06.006