雷蒙德氏棉擴展蛋白基因家族的鑒定和特征分析

雷忠萍，賀道華，海江波，邢宏宜，趙俊興，程雪妮

(1.西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

雷蒙德氏棉擴展蛋白基因家族的鑒定和特征分析

雷忠萍1，2，賀道華1，海江波1，邢宏宜1，趙俊興1，程雪妮2

(1.西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

擴展蛋白具有松馳細胞壁和增加細胞壁柔韌性的功能。為了弄清該基因家族在雷蒙德氏棉中的特征，利用隱馬爾科夫模型(HMM)在雷蒙德氏棉基因組中進行擴展蛋白家族基因成員的鑒定，獲得了39個擴展蛋白基因家族成員，分布在12條染色體上。系統發育分析將其歸入EXPA、EXPB、EXLA和EXLB共4個亞家族，分別含有26，4，3，6個基因。各亞家族中擴展蛋白基因具有相對多樣化的基因結構；擴展蛋白基因家族在進化中經歷了3次擴張；染色體片段重復是該基因家族擴張的主要方式；擴張后純化選擇占主導地位。比較棉纖維發育不同時期及葉片、花瓣的深度測序和基因芯片表達譜，發現大部分擴展蛋白基因參與了雷蒙德氏棉纖維、葉片和花瓣的生長發育，在不同的時空范圍均表現出表達多樣性。GrEXLA1、GrEXLA2和GrEXPA16在花瓣中優勢表達，GrEXPA23和GrEXPA24在葉片中表達水平較高，推測這些基因的表達分別參與了花瓣和葉片的發育進程；其余的基因，在纖維的不同發育階段，表現出不同的表達豐度。研究結果有助于了解棉屬擴展蛋白基因家族的特征及功能，為深入剖析棉纖維發育過程中的分子調控機理提供了基礎。

雷蒙德氏棉；擴展蛋白；基因結構；系統發育分析；進化分析；表達模式

擴展蛋白(Expansin)是一類植物細胞壁伸展蛋白，是植物細胞壁的重要組分，廣泛存在于各種植物細胞組織中。擴展蛋白一般由205～275個氨基酸組成，氨基末端含有1個長度為20～30個氨基酸的信號肽[1]；中段含有1個類似于Glycoside hydrolase family 45的結構域DPBB_1，長度為120～135個氨基酸；羧基端含有結構域Pollen_allerg_1，長度為90～120個氨基酸。在植物細胞壁伸展研究中，Mcqueen-Mason等[2]首次從黃瓜胚軸中分離出擴展蛋白。近年來，由多基因家族編碼的擴展蛋白在越來越多的物種中被鑒定，如葡萄(29個擴展蛋白家族成員[3])、蘋果(41個[4])、楊樹(36個[5])、玉米(88個[6])、大豆(75個[7])和大白菜(53個[8])。依據系統進化關系，擴展蛋白可以分為4個亞家族，分別是EXPA、EXPB、EXLA和EXLB(也稱α、β、γ和δ亞家族[9])。其中，亞家族EXPA在大多數植物中是最大的1個亞家族，其次是亞家族EXPB[10]。

功能研究表明，擴展蛋白參與許多生長發育過程，如種子發芽[11]、根毛的起始和伸長[12-13]、木質部形成[14]、花粉管伸長[15-16]、水果成熟軟化[17]和葉片脫落[18]等；在植物抗逆[19-20]中擴展蛋白也有重要作用。研究表明，擴展蛋白在特定的pH梯度下，以酶催化的作用方式，使細胞壁組分間疏松，細胞伸展，細胞的柔韌性增強，以此緩解各種環境因子對細胞的機械壓力[2，10]。EXPA亞家族更多作用于植物的生長發育[12，21]和抗性[22]，EXPB亞家族則趨向于在生殖系統[23-24]中起作用。然而，EXLA和EXLB兩類亞家族僅僅知道其基因序列[1]，尚沒有試驗證據發現其具有增加細胞壁柔韌性的功能[5]。

棉纖維是世界上重要的紡織原料之一，具有極其重要的經濟價值。它是由胚珠外珠被表皮層的單細胞分化發育而成，大約歷時45～50 d，包含著4個依次并部分重疊的發育時期：纖維原始細胞的分化和突起、初生細胞壁伸長、次生細胞壁加厚和脫水成熟。研究表明纖維的發育涉及大量基因的表達和蛋白相互作用[25]。因此，棉纖維是單細胞生長發育的典型模型[26]和最佳研究材料，剖析其發育過程的機理意義重大[27]。纖維的伸長與細胞壁的松弛密切相關，而擴展蛋白能夠打斷纖維素微絲間的氫鍵，從而使細胞壁延展疏松。EST數據庫分析顯示，在纖維細胞迅速伸長時期，4個編碼擴展蛋白的基因轉錄水平較高，而在后續的次生壁合成期后這4個基因的轉錄量顯著降低[28]，暗示了它們主要在棉纖維細胞伸長期發揮功能。

目前，異源四倍體的陸地棉(Gossypiumhirsutum，染色體組AADD)是栽培面積及經濟價值最大的棉種。普遍認為，在100～200萬年前，雷蒙德氏棉(G.raimondii，染色體組DD)的祖先與亞洲棉(G.arboreum，染色體組AA)的祖先之間發生遠緣雜交，雜交后代經染色體加倍然后進化成現今的陸地棉。雷蒙德氏棉基因組的測序工作已完成[29-30]，為棉屬基因組的研究開創了新局面。本研究利用生物信息學方法，對雷蒙德氏棉全基因組的擴展蛋白家族基因進行了預測和系統進化分析，并對其在棉纖維等組織發育過程中的表達模式進行分析，旨在為棉花優質、高產等重要農藝性狀提供候選基因，為基因組水平上的棉花分子育種工作提供基礎研究依據。

1 材料和方法

1.1 雷蒙德氏棉中搜索擴展蛋白基因家族成員

本試驗的雷蒙德氏棉(G.raimondii)基因組及蛋白質序列均來自于DOE Joint Genome Institute(JGI)網站(ftp：//ftp.jgipsf.org/pub/)。擴展蛋白家族成員序列信息下載于Daniel Cosgrove實驗室的網站(http：//www.personal.psu.edu/)。擴展蛋白特有的保守結構域DPBB_1(pfam03330)和Pollen_allerg_1(pfam01357)來自網站http：//pfam.xfam.org/。利用基于隱馬爾可夫模型的軟件HMMER(http：//hmmer.janelia.org/)和本地化的Blast 2.2.26(ftp：//ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/)軟件，在雷蒙德氏棉全蛋白質序列數據庫中搜索擴展蛋白基因。

1.2 系統發育樹的構建及基因命名

利用ClustalW對雷蒙德氏棉擴展蛋白家族的氨基酸序列(以擬南芥、水稻的擴展蛋白序列作為outgroup)進行序列比對，利用MEGA v5.1采用Neighbor-Joining算法構建系統發育樹，從而將鑒定出來的雷蒙德氏棉擴展蛋白進行亞家族分類，在亞家族內根據其在染色體上的位置順序進行命名。

1.3 擴展蛋白家族基因的結構、染色體物理定位和基因復制共線性分析

利用擴展蛋白基因的編碼區序列(CDS)與全基因組序列比對，在網站http：//bio.ieo.eu/fancygene/得到基因結構圖。利用Blast工具將所獲得的擴展蛋白基因序列，定位到基因組的各染色體上；同時，在Phytozome的數據庫中對結果進行驗證。利用MCScanX進行擴展蛋白家族基因成員倍增模式(基因復制共線性)分析，利用Circos繪制擴展蛋白基因在染色體上的物理位置及基因間的共線性關系。利用perl代碼計算具有共線性關系的旁系同源基因對間的Ks、ω值(Ka/Ks)和4DTv。

1.4 擴展蛋白序列分析及理化性質分析

采用軟件BioEdit v7.1對雷蒙德氏棉中擴展蛋白家族成員的mRNA和氨基酸序列進行一致性分析；使用DnaSP 5.10程序對雷蒙德氏棉中擴展蛋白密碼子偏好性(Codon Usage Bias)進行統計；在http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析信號肽；通過軟件MEME 4.8.0以及在線軟件ProtParam對雷蒙德氏棉中擴展蛋白的結構保守性、蛋白穩定性及相關的理化性質進行考察；利用Euk-mPLoc 2.0 (http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/#)預測每個蛋白的亞細胞定位信息。

1.5 深度測序表達譜的獲得與分析

雷蒙德氏棉的葉片、纖維和胚珠不同時期的深度測序和基因芯片表達譜數據下載于NCBI網站SRA數據庫和GEO數據庫。表達譜原始數據文件登錄號見表1。參照He等[31]方法分析擴展蛋白基因家族每個基因的表達量，并識別差異表達基因。

表1 雷蒙德氏棉擴展蛋白家族基因表達譜分析數據Tab.1 Details of RNA-seq and microarray dataset mined for analysis of expansin expression profiles

2 結果與分析

2.1 雷蒙德氏棉擴展蛋白基因家族

根據擴展蛋白特有的保守結構域DPBB_1和Pollen_allerg_1，運用HMMER軟件將多序列比對結果轉化為擴展蛋白基因家族的HMM profile文件，在蛋白序列庫搜索具有目標結構域的蛋白序列。在雷蒙德氏棉全基因組中共檢索到39個擴展蛋白基因家族成員，經過Blast 和結構域分析，確定這39個基因均具有擴展蛋白家族的保守結構域。其中，26個基因屬于EXPA亞家族，4個基因歸為EXPB亞家族，3個基因歸為EXLA亞家族，6個基因歸為EXLB亞家族。按其在染色體上的位置分布，將這39個擴展蛋白基因依次命名為：GrEXPA01～GrEXPA26、GrEXPB1～GrEXPB4、GrEXLA1～GrEXLA3和GrEXLB1～GrEXLB6(表2)。與擬南芥(Arabidopsisthaliana)及楊樹(Populustrichocarpa)基因組相比較，雷蒙德氏棉基因組中包含較低比例的EXPA亞家族基因，約占基因家族總成員數的67%。在已測序的同為雙子葉植物的擬南芥和楊樹基因組中，這一比例分別為72%和75%(表3)。而在已測序的單子葉植物的水稻(Oryzasativa)基因組中，EXPA亞家族擴展蛋白基因的比例為59%。比較而言，雷蒙德氏棉中EXLA亞家族擴展蛋白基因的比例較小，約為7.7%，同為雙子葉植物的擬南芥和楊樹中的這一比例約為8.3%和5.6%，而單子葉植物水稻中的EXLA亞家族擴展蛋白基因的比例為6.9%(表3)。

2.2 擴展蛋白基因在染色體上的分布及共線性分析

雷蒙德氏棉基因組包含13對染色體，根據基因組測序結果，將雷蒙德氏棉擴展蛋白基因家族的39個成員進行染色體定位。結果表明，除了染色體Gr10外，39個擴展蛋白基因分別位于雷蒙德氏棉的其余12條染色體上，并且擴展蛋白基因在染色體上的分布較為分散(圖1)。染色體Gr03上僅1個擴展蛋白基因，染色體Gr04上多達7個擴展蛋白基因，且染色體Gr04上3個擴展蛋白基因緊密串聯(成簇分布)，4條染色體(Gr05、Gr07、Gr11和Gr12號)上均具有3個擴展蛋白基因。

表2 雷蒙德氏棉擴展蛋白基因家族成員鑒定Tab.2 Identification of expansin gene family members from G.raimondii

注：(+)和(-)分別表示該基因位于染色體正鏈和負鏈上。

Note：(+) and(-) indicated the forward and reverse orientation，respectively.

表3 不同植物擴展蛋白及其4類亞家族基因數目Tab.3 Number of expansin family members identified in various organisms

共線性分析顯示，部分擴展蛋白基因之間存在著交叉的共線性關系，如GrEXPA01/GrEXPA04/GrEXPA10、GrEXPA05/GrEXPA08/GrEXPA09、GrEXPA16/GrEXPA20/GrEXPA21/GrEXPA23、GrEXLA1/GrEXLA2/GrEXLA3等(圖1)，表明這些擴展蛋白基因位于染色體倍增塊(Duplicated block)上，即基因組進化過程中，含有這些擴展蛋白基因的染色體區段(大片段)發生了倍增(Duplication或Paleopolyploidy)。數據顯示，共有30個擴展蛋白基因分屬于11組染色體倍增塊上(表4)，其中5組倍增塊由2個以上的染色體區段構成，說明這些擴展蛋白基因還存在著交叉匹配的現象。例如：GrEXPA01、GrEXPA04和GrEXPA10倍增塊；GrEXPA16、GrEXPA20、GrEXPA21和GrEXPA23倍增塊。這些倍增塊的產生可能是由于染色體多次復制，從而使得倍增塊內的數個基因間具有共線性的旁系同源或橫向同源關系(Paralog)。這些信息顯示了擴展蛋白基因家族在雷蒙德氏棉中的擴張歷程。表4顯示，倍增塊內基因間的ω值(Ka/Ks)<1，顯示在經歷了古老的基因組加倍(Paleopolyploidy)后，擴展蛋白成員數增加，但主要經歷著純化選擇(Purifying selection)，所以倍增塊內，基因間差異較小。Ks分布密度(圖2)顯示出3個峰值(0.516 9，1.275 3和1.685 4)，表明了在17.2(Million years)，98.1，129.6 Myr前擴展蛋白家族基因所在區段發生了3次擴張。數據顯示，具有共線性的旁系同源基因對，其4DTv(4倍簡并位點)值大部分(75%)為0.393 9～0.952 2，表明旁系同源基因對經歷了很漫長的進化歷程。

外層圓圈表示染色體Gr01-Gr13；圈內曲線表示基因間存在共線性。Chromosome(Gr) 01-13 are depicted as curve bars；Curve lines denote collinear regions containing expansin family genes.

2.3 雷蒙德氏棉擴展蛋白家族基因結構分析

對雷蒙德氏棉擴展蛋白基因序列統計分析顯示，各擴展蛋白基因在基因組中的長度為981～2 922 bp (只有基因GrEXPA12，因為第3個內含子極長(圖3)，所以其核苷酸序列長達7 372 bp；黃瓜中也存在一個內含子極其長的EXPA基因[32])，而編碼蛋白的外顯子部分序列全長為735～870 bp，可編碼244～289個氨基酸(但也存在特例，如：GrEXPB3短至176 aa，GrEXPA07長至303 aa)。植物擴展蛋白基因的內含子模式(Intron pattern：losses，presence and location(in the gene) of intron)具有較大的保守性，Sampedro等[33]對不同物種擴展蛋白基因內含子序列的統計分析發現，不同內含子可能具有不同的起源，并由此將其分為G、A、B、C、F 和H共6種不同的類型。在雷蒙德氏棉中，全部擴展蛋白基因均含有A類型內含子，82.1%(32/39)的成員含有B類型內含子，而含有G、C、F和H類型內含子的擴展蛋白基因比例分別為15.4%(6/39)，25.6%(10/39)，28.2%(11/39)和2.6%(1/39)。EXPA亞家族擴展蛋白基因含有4種內含子結構模式([A]、[AB]、[GAB]和[ABH])，EXPB亞家族成員的內含子結構模式為[AB]、[ACB]、[ABF]，EXLA亞家族成員的內含子結構模式為[ACBF]，而EXLB亞家族的結構模式則為[ACF]、[ACBF]和[GACF]。

表4 雷蒙德氏棉擴展蛋白基因倍增模式Tab.4 The segmental duplication events of expansin gene superfamily in G.raimondii

注：倍增基因對.具有共線性關系的基因集合。

Note：Set.Collinear gene set.

圖2 具有共線性關系的expansin基因間Ks分布頻率Fig.2 Frequency distributions of Ks of collinear paralogous expansin gene pairs in G.raimondii

2.4 序列一致性分析及系統進化樹

擴展蛋白基因序列一致性比較發現，同一亞家族內成員間編碼區核苷酸序列的一致性均在48.4%以上，氨基酸序列的一致性高于44.8%；而亞家族成員間，編碼區核苷酸序列的一致性均低于45.28%，氨基酸序列的一致性則低于34.38%(表5)。相對而言，EXPA與EXPB亞家族之間親緣關系較近，氨基酸序列一致性為15.0%～31.5%；EXLA與EXLB亞家族間親緣關系更近，氨基酸序列一致性為29.5%～37.3%，而EXPA或EXPB與EXLA或EXLB間的氨基酸序列一致性相對較低(一般小于28.9%)。因此，基因編碼區序列一致性比對可以作為擴展蛋白亞家族分型的重要依據。

表5 雷蒙德氏棉擴展蛋白家族成員間核苷酸及氨基酸序列一致性分析Tab.5 Identity of nucleotides(above) and amino acid(below) between two subfamilies of expansin genes in G.raimondii

依據擴展蛋白基因的氨基酸序列構建系統進化樹顯示，每一亞家族的成員往往聚集成群(圖3)。依據內含子特點、相似程度的差異以及共線性分析[5，33]，這些基因可進一步劃分為15個大的分支(EXPA、EXPB、EXLA和EXLB亞家族分別包含10，2，1，2個分支)，每1分支中的擴展蛋白基因之間，無論是氨基酸序列還是基因的結構組成都具有更大的一致性。如具有共線性關系的基因GrEXPA01/GrEXPA04/GrEXPA10、GrEXPA05/GrEXPA08/GrEXPA09、GrEXPA06/GrEXPA17/GrEXPA24、GrEXPA16/GrEXPA20/GrEXPA21/GrEXPA23、GrEXLA1/GrEXLA2/GrEXLA3分別位于同一分支上，其氨基酸序列的相似性分別達到79.0%，77.3%，81.0%，90.1%，80.0%，并且外顯子數量、每個外顯子大小也保持較高的一致性，預示其基因起源甚至功能方面有一定的關聯，也暗示著高等植物進化過程中普遍存在三倍化(Triplicated)甚至四倍化(Tetraplicated)事件等。

2.5 雷蒙德氏棉擴展蛋白密碼子偏好性分析

蛋白質中的氨基酸是由mRNA中三聯體密碼子決定，每種氨基酸至少對應著1個密碼子，最多的對應著6個密碼子(即同義密碼子)。在蛋白質的合成過程中，同義密碼子的使用概率并不相同，對雷蒙德氏棉擴展蛋白基因家族39個成員的10 041個密碼子的使用偏好性進行統計發現，密碼子有效數(Effective number of codons，ENC)為53.955，密碼子偏愛指數(Codon bias index，CBI)為0.149。有些氨基酸密碼子相對使用頻率(Relative frequency of synonymous codon，RFSC)具有明顯的密碼子偏好性(表6)，其中CCU(編碼Pro)、GCU(編碼Ala)、AGA 和AGG(均編碼Arg)、UAA(編碼終止子TER)分別為相應氨基酸的高頻密碼子(相對同義密碼子使用頻率單值超過60% 或超過該組同義密碼子平均占有頻率的1.5倍的密碼子[34])。雷蒙德氏棉的4個高頻密碼子(CCU、GCU、AGA和AGG)在擬南芥、楊樹等雙子葉植物中同樣為高頻密碼子。另外，在雷蒙德氏棉中，CCG(編碼Pro)、ACG(編碼Thr)、GCG(編碼Ala)、CGG(編碼Arg)和UGA(編碼TER)屬于稀有密碼子。

圖3 雷蒙德氏棉擴展蛋白基因的系統發生樹(左)、基因結構(中)及模體結構(右)Fig.3 Phylogenetic tree，gene structure and motif analysis of the G.raimondii expansin

表6 雷蒙德氏棉擴展蛋白基因密碼子的相對使用頻率Tab.6 RFSC value of expansin genes in G.raimondii

注：下劃橫線和波浪線分別表示低頻和高頻密碼子。

Note：Underline and wavy-underline indicated low-frequency and high-frequency codons.

2.6 雷蒙德氏棉擴展蛋白的一級結構

雷蒙德氏棉擴展蛋白和其他物種中的擴展蛋白具有相類似的一級結構，由信號肽、催化區(DPPB_1結構域)、結合區(Pollen_allerg_1結構域)3部分組成[1]。MEME模體分析結果如圖(圖3，4)所示。雷蒙德氏棉中，大部分(31/39)擴展蛋白的N端的信號肽區含有17～34個氨基酸，可以引導初生多肽透過內質網。MEME模體分析顯示，信號肽區段包含Motif15(圖4)。位于擴展蛋白序列中段的是催化區(Catalysis domain)，其核心序列與內切葡聚糖酶GH45(纖維素酶系中的1個主要成分，可在葡聚糖鏈的隨機位點降解底物產生寡糖)具有較高的一致性，并且含有豐富的保守性很高的半胱氨酸(Cys，即C，圖4)，推測與二硫鍵的形成有關[35]。MEME模體分析還顯示，雷蒙德氏棉的EXPA亞家族的催化區由Motif2(r)+Motif6+Motif3組成；其他3個亞家族的催化區由Motif11(r)+Motif10+Motif8(l)組成。另外，在EXPA和EXPB亞家族的DPPB_1結構域中含有1個His-Phe-Asp(HFD)模體。位于擴展蛋白羧基端的部分是纖維素結合區(Cellulose-binding domain)，也叫多糖結合區(Polysaccharide-binding domain)，多由最后1個外顯子編碼，長度一般為90～120個殘基，如EXPA亞家族基本上由101～104個氨基酸組成。該區段擁有豐富的色氨酸(Trp，即W)，在4個亞家族之間也具有很高的保守性。有分析認為，色氨酸微環境對pH值變化非常敏感，降低pH值可以導致蛋白分子構象發生較大變化[36]，并影響擴展蛋白的功能。MEME模體分析顯示，EXPA亞家族的多糖結合區Motif1(r)+Motif4+Motif7(l)；其他3個亞家族的催化區由Motif8(r)+Motif9+Motif12組成。

2.7 雷蒙德氏棉擴展蛋白理化特征分析

蛋白質的理化特性與其功能特征密切相關。雷蒙德氏棉39個擴展蛋白的分子量從18.48 kDa到33.77 kDa不等，平均值為27.87 kDa；其蛋白最短的有176個氨基酸殘基，最長的有303個，平均值為256.46，跨度較大(表2)。根據擴展蛋白的氨基酸序列，利用軟件Euk-mPLoc 2.0[37]進行亞細胞定位預測，發現雷蒙德氏棉的39個擴展蛋白全部定位于細胞外(Extracell)。

圖4 雷蒙德氏棉擴展蛋白ExpA亞家族成員氨基酸序列保守性分析Fig.4 Conservation analysis of amino acid sequences among subfamily expansin A genes in G.raimondii genome

分析表明，家族39成員蛋白質的理論等電點(pI)為4.44～10.45，平均值達到8.213，表明多數雷蒙德氏棉擴展蛋白表現偏堿性，與楊樹的擴展蛋白表現相近。對總平均疏水性(Grand average of hydropathicity，GRAVY)的計算發現，大部分(36/39)蛋白都屬于親水性的蛋白(-0.244～-0.015，正值表示疏水性，負值表示親水性[38])，僅3個蛋白屬于弱的疏水性蛋白。家族成員的蛋白不穩定性指數(Instability index，II)為16.96～45.39，平均值達到31.96；除GrEXPA07外，多數擴展蛋白結構穩定性較好(> 40則不穩定)。雷蒙德氏棉擴展蛋白的脂溶指數(Aliphatic index，AI)為59.64～84.98，平均值為71.17；相對較高的脂溶指數，保證該蛋白在各種環境中具有良好的穩定性，有利于其功能的正常發揮。GrEXLA1、GrEXLA2、GrEXLA3、GrEXLB2、GrEXLB4、GrEXLB5、GrEXLB6和GrEXPB3的脂溶指數甚至超過80，屬于嗜熱型蛋白[39]。

2.8 擴展蛋白家族成員在雷蒙德氏棉不同組織/器官、纖維發育不同時期中的表達特征分析

在雷蒙德氏棉3個不同組織/器官及纖維發育時期(成熟葉片、花瓣、0 d胚、2 d纖維、3 d胚、10 d種子、20 d種子、30 d種子和40 d種子)的轉錄組測序和芯片雜交數據中，7個基因表達試驗項目(表1)共檢測到34個擴展蛋白基因的表達(圖5)，其他5個基因(GrEXPA08、GrEXPA09、GrEXPA10、GrEXPB3和GrEXLB4)一直未檢測到表達信號，推測這5個擴展蛋白基因為假基因。在花瓣、葉片和纖維中分別有15，10，6個基因沒有表達信號。基于基因芯片的表達數據顯示：19個基因未檢測到表達；深度測序數據顯示：6個基因未檢測到表達。

基因芯片和深度測序顯示：GrEXLA1、GrEXLA2和GrEXPA16在花瓣中表達量較高；在葉片中，GrEXPA23和GrEXPA24表達量較高，而GrEXLA1和GrEXPA02表達量較低。GrEXPA11、GrEXPA16、GrEXPA21和GrEXLB2在葉片和花瓣中活躍表達而在纖維中遲鈍或沉默。這些結果表明，擴展蛋白基因的表達在不同的組織中具有特異性。

利用深度測序數據分析擴展蛋白基因在棉纖維發育階段及成熟葉片中的表達譜。Levels of gene expression are depicted in different color on the right scale.

在纖維發育的起始階段(0～8 d)，GrEXPB1、GrEXPB2和GrEXLB2的表達量極低，說明這些基因可能不會促進胚珠的表皮細胞發育成纖維。GrEXPA22僅在起始期甚至伸長期2個時期表達，后期不再表達。GrEXLA3和GrEXLB5在伸長期的表達量顯著高于纖維發育的其他時期。GrEXPA19前期(起始期、伸長期、次生壁合成期共3個時期)活躍，異常高表達，在0～20 d時間內表達量特高，進入成熟期(20 d以后)表達量迅速下降，接近為0。GrEXPA24在纖維的整個發育期均表達，但表達量持續地顯著(P<0.05)下降。與此相反，GrEXPA02、GrEXPA12、GrEXPA14、GrEXPA15、GrEXPA17、GrEXPA18、GrEXLA2和GrEXLB3在次生壁合成期及成熟期高量表達。特別是GrEXPA17和GrEXPA23，在成熟期表達量特高。GrEXPA13在次生壁合成期表達量高。這些結果都顯示，擴展蛋白基因的表達特征呈現多樣化，表達在纖維發育的某一時期具有特異性。在3個基因表達研究項目(SRP017168、SRP009820和SRP001603)內，進行組織/時期間的比較分析(圖5)，發現18個擴展蛋白基因的表達豐度，在不同時期內存在顯著差異(P<0.05)，推測這18個基因在棉纖維發育各個過程中均起重要作用。

總的來看，亞家族內的不同基因有不同的表達特征，表明進化進程中，亞家族內同類基因其結構的趨異性和功能分化的多樣性可能是相互關聯的。

3 討論與結論

本試驗在全基因組水平上對雷蒙德氏棉擴展蛋白基因進行了鑒定和特征分析。雷蒙德氏棉擴展蛋白家族共有39個成員，其中包括26個EXPA、4個EXPB、3個EXLA和6個EXLB基因，與擬南芥、楊樹、蘋果、菜豆中該基因家族成員個數接近(表3)。Sampedro 等[1]認為，在植物界各物種分化前的共同祖先中，擴展蛋白家族大約含有15～17個成員。在后續的進化過程中，植物界各物種的基因組大多經歷了多次的全基因組復制事件[30]，這是基因家族成員數量擴張的重要原因。本試驗表明，雷蒙德氏棉擴展蛋白家族成員數量相比于擬南芥、楊樹、蘋果、菜豆的成員數量，在進化過程中經歷了相同次數的復制事件。Ks的分布頻率曲線和成員數量均表明，進化中雷蒙德氏棉擴展蛋白大約經歷了3次復制事件。將蛋白序列提交Euk-mPLoc網站，亞細胞定位預測顯示39個成員全部定位于細胞外，表明該家族蛋白的亞細胞定位分化具有高度保守性。

雷蒙德氏棉的基因組經歷了全基因組重復、染色體重排和串聯重復等復雜的進化過程[40]。本試驗結果表明，染色體大片段復制在擴展蛋白家族成員的擴增中起到了重要作用。在雷蒙德氏棉中共有30個擴展蛋白家族基因形成11個共線性支持的基因群(由同一基因祖先擴增而來)，基因群內的基因在系統發育樹中大多也處于同一分支內。根據系統發育樹的分支進行分組，比較亞家族下的亞組(分支)內擴展蛋白家族基因的內含子、外顯子排布情況、UTR長短、信號肽的有無及基序(結構域、信號肽)的分布情況，可以發現，同一亞組(分支)中各基因的基因結構具有一定的差異。但利用MEME進行模體分析，結果顯示同一亞組(分支)中各基因翻譯出的蛋白質具有類似(相對保守)的氨基酸結構。從不同時空的表達數據來看，這些由同一基因祖先擴增而來的基因群，并不具有相似的表達模式，說明在進化過程中其表達時空特性發生趨異分化現象，這可能與基因家族擴張后基因結構的趨異化有一定的聯系。

雷蒙德氏棉是現今四倍體栽培棉物種的D亞組染色體的祖先的現代種，研究擴展蛋白基因的多次復制現象可以幫助人們更好地了解棉屬基因組多倍化的形成過程。將棉花與水稻、擬南芥、楊樹等12個物種的擴展蛋白基因家族進行比較，發現所列各物種的擴展蛋白家族成員個數并不與基因組大小完全成正比，說明擴展蛋白基因家族在各物種中的進化和復制具有多樣性。眾所周知，多倍體化(Paleopolyploidy)在陸生植物的進化過程中多次發生，并且這些多倍化事件對植物基因家族的擴張起到了重要作用，最終產生了基因冗余。冗余是生物為適應外界不利環境的一種對策，對生命系統有重要的意義[41]。雷蒙德氏棉擴展蛋白家族基因成員的冗余，也從側面表明了該家族成員在其生長發育過程中的重要作用。該家族各亞族內成員之間在蛋白質水平有很強的保守性：MEME軟件Motif分析的結果表明，各亞族的序列相似性很高；但從基因結構來看，各亞族的成員間基因結構存在一定差異，如：內含子模式存在多樣性、UTR長短不一等，這可能與基因組進化過程中的串聯重復、隨機重復與插入等現象有關。據此推測，在基因冗余發生后，通過非編碼區的趨異化，從而改變冗余基因間表達的時空依賴性，達到節約胞內資源，穩定細胞代謝，適應胞外環境的能力(Functional specialization)。深度測序和基因芯片的數據也表明，具有共線性關系的基因之間，其表達模式各不相同，其原因可能也在于此。擴展蛋白家族基因從植物界共同祖先的15～17個成員擴增到雷蒙德氏棉的39個成員，有可能經歷了3次多倍化事件。在每次的多倍化事件后，因為基因的冗余，少數擴展蛋白基因可能經歷了丟失(Selective loss of genes)或者去功能化(Dysfunctional或Neo-functionalization)或者轉變(Gene conversion)，剩余基因在純化選擇(Negative selection)壓力(如ω值所示)的作用下進化成現今的39個成員。

纖維發育進程中涉及大量基因的表達，其中擴展蛋白基因在處于伸長期的纖維細胞中表達異常活躍[42-44]，而在短絨或無纖維突變體中下調表達[45]。因此，擴展蛋白基因可能對纖維發育極其重要，對促進纖維(單)細胞的胞壁的伸長具有重要的作用，從而最終影響纖維的長度和強度。Harmer等[43]在纖維細胞中發現6個編碼α擴展蛋白的cDNA(GhExp1～GhExp6)，RT-PCR表達分析表明，GhExp1(屬于擴展蛋白A亞家族)僅在伸長期的纖維中高量表達，GhExp2 (A亞家族)也是僅在伸長期的纖維中表達，表明這2個基因可能促進纖維的伸長。轉基因過量表達GhEXPA1顯示，GhEXPA1與GhRDL1互作，可以顯著地增加單株鈴數，從而提高纖維產量40%而對纖維品質無負面影響[46]。He等[47]通過關聯作圖發現，基因Exp2的序列多態性與纖維品質的變異顯著相關。基因GbEXPA2在伸長階段的纖維中顯著地上調表達[48]，深入的研究發現GbEXPA2的啟動子主要在纖維中活躍表達[49]。基于陸地棉與海島棉種間滲入系的基因表達分析顯示，與纖維品質低劣的滲入系相比較，擴展蛋白基因(α-expansin 1、expansin-like B1等)在纖維品質優良的滲入系里表達更活躍，進一步試驗發現，在纖維的伸長階段擴展蛋白基因表達顯著升高[50]。由此推測，擴展蛋白家族一些基因成員在棉纖維的發育過程中對纖維細胞的伸長起到調控作用，當這些基因表達下調時，會影響棉纖維的發育，導致纖維的重要品質指標(長度和比強度)下降。

本試驗對雷蒙德氏棉擴展蛋白家族基因在不同時空范圍的表達譜進行了分析發現，除了5個基因外，其余擴展蛋白基因廣泛參與到棉纖維、葉片、花瓣等組織發育的復雜生理過程中。在纖維發育的不同時期，特異性表達的擴展蛋白基因各不相同，在纖維發育后期轉錄量上升的擴展蛋白基因，如GrEXPA17和GrEXPA23等，可能協助纖維細胞脫水與成熟；在中期轉錄量高的基因，如GrEXPA13等，可能協同其他基因一起促進纖維初生壁的延展和次生壁纖維素的沉積；而在分化時期轉錄水平顯著較高的擴展蛋白基因，如GrEXPA22，可能參與胚珠表皮細胞的分化和突起過程。特別指出GrEXPA19在20 dpa前的胚珠中轉錄水平很高，推測其在纖維發育中起著重要作用。本試驗利用RNAseq數據和芯片數據對擴展蛋白基因家族在棉花纖維等發育過程中的作用進行了初步探索，而其參與每一發育過程的分子調控機制還有待進一步的研究。

本試驗利用雷蒙德氏棉基因組測序的數據庫，首次對棉花中擴展蛋白家族基因進行了鑒定和生物信息學分析，鑒定出了39個擴展蛋白家族的成員，并對它們進行了進化分析、基因結構分析、蛋白特征分析以及時空表達模式分析，發現雷蒙德氏棉中擴展蛋白家族基因成員參與了纖維、葉片、花瓣等多種組織的發育過程。鑒定和研究雷蒙德氏棉擴展蛋白家族的特征可為進一步探討陸地棉、海島棉相關基因的功能提供依據，對創制優異的種質資源、培育優良的棉花新品種具有重要的意義。

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Genome-wide Identification and Characterization of Expansin Gene Family in Gossypium raimondii

LEI Zhongping1，2，HE Daohua1，HAI Jiangbo1，XING Hongyi1，ZHAO Junxing1，CHENG Xueni2

(1.College of Agronomy，Northwest A&F University，Yangling 712100，China； 2.College of Life Sciences，Northwest A&F University，Yangling 712100，China)

Expansin can loosen the components of rigid plant cell walls and thereby allow cell expansion.To get insight into expansin genes inGossypiumraimondii，genome-wide exploration and comprehensive characterization of theG.raimondiiexpansin gene family members were conducted，and 39 expansin genes(including 26EXPA，4EXPB，3EXLAand 6EXLB，which was classified based on the phylogenetic tree) were identified.The results revealed that expansin family genes were located on 12 of 13G.raimondiichromosomes.And the gene structures were relatively diverse(not conserved) in each subgroup.Evolutionary analysis of expansins revealed that chromosome segmental duplications contributed mainly to the three evolutionary expansions of expansin family，which had experienced negative selection pressure.The expression pattern of expansin genes under series of fiber development stages，in leaf and petal indicated that most expansin genes(showing diverse and specific expression pattern) might participate in fiber development processes including fiber initiation and elongation，and in morphogenesis of leaf and petal.This identification and characterization provided the complete profiles ofGossypiumexpansin family genes for future study on their functions related to the molecular mechanisms of fiber and other tissues development.

Gossypiumraimondii；Expansin；Gene structure；Phylogenic analysis；Biological evolution；Expression pattern

2016-07-21

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-18-45)；轉基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX08005-002)

雷忠萍(1979-)，女，湖北保康人，實驗師，在讀碩士，主要從事棉花遺傳學研究。

海江波(1966-)，男，陜西扶風人，副教授，博士，主要從事高效耕作制度及農業生態研究。 賀道華(1975-)，男，湖北隨州人，講師，博士，主要從事棉花生物技術育種研究。

Q78

A

1000-7091(2016)06-0044-12

10.7668/hbnxb.2016.06.008