基于Meta分析構(gòu)建抗玉米粗縮病的染色體單片段代換系

寶華賓，梁帥強(qiáng)，林 峰

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

基于Meta分析構(gòu)建抗玉米粗縮病的染色體單片段代換系

寶華賓1，2，梁帥強(qiáng)2，林 峰2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

為發(fā)掘玉米粗縮病抗性基因，解析其遺傳規(guī)律。借助IBM2 2008 Neighbors遺傳圖譜，整合已報(bào)道的92個(gè)抗玉米粗縮病QTLs(Quantitative trait locus)，通過Meta分析獲得24個(gè)“一致性”抗病區(qū)間。利用生物信息分析，確定抗病區(qū)段的物理位置信息，在相關(guān)區(qū)段對(duì)鄭58和齊319的全基因組重測(cè)序序列分析鑒定出7 142個(gè)InDel位點(diǎn)，其中546個(gè)含有InDel位點(diǎn)的序列可用于引物開發(fā)，進(jìn)一步通過試驗(yàn)篩選出在鄭58和齊319第2，4，5，6，7，8，10號(hào)染色體上的多態(tài)InDel位點(diǎn)158個(gè)。以抗粗縮病玉米自交系齊319為供體親本，感病優(yōu)良自交系鄭58為受體親本，利用上述InDel標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建整套染色體單片段代換系材料。為抗玉米粗縮病QTL位點(diǎn)的精細(xì)定位提供了可能，也為抗病育種提供新的種質(zhì)資源。

玉米；粗縮病；Meta分析；染色體單片段代換系

玉米粗縮病是由植物病毒引起的病害，導(dǎo)致玉米植株矮化、葉片短寬肥厚、產(chǎn)量明顯下降，已成為我國玉米生產(chǎn)區(qū)的主要病害之一[1]，嚴(yán)重制約我國玉米生產(chǎn)，因此，開展對(duì)玉米粗縮病的研究具有十分重要的意義。解析粗縮病抗性遺傳規(guī)律，發(fā)掘抗性基因，可為玉米抗粗縮病育種提供理論基礎(chǔ)。

迄今為止，除第3，9號(hào)染色體外，玉米的其余染色體上鑒定出抗粗縮病QTL數(shù)量均較多[1-20]，王飛[1]利用掖478×90110構(gòu)建的F2群體，150個(gè)單株通過SSR-BSA分析，檢測(cè)出4個(gè)與粗縮病抗性基因連鎖的標(biāo)記：umc1656(bin6.02)、umc1401(bin7.02)、bnlg1823(bin8.07)和umc1268(bin8.07)。商偉等[14]利用80007×80044構(gòu)建重組自交系，以205份單株的F5群體結(jié)合完備區(qū)間作圖法(Inclusive composite interval，ICIM)定位到7個(gè)QTL，分布在第1，2，5染色體上。石明亮等[15]借助GY220×1145雜交衍生的重組自交系群體，以109個(gè)單株的F10：11家系采用復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite interval mapping，CIM)發(fā)現(xiàn)在第4號(hào)染色體上存在5個(gè)抗粗縮病的QTL。但是，由于群體大小、群體類型、試驗(yàn)環(huán)境、統(tǒng)計(jì)方法不同，上述研究定位的區(qū)域較寬，難以找到與抗病QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記；同時(shí)由于多采用初級(jí)群體，定位精度較差，導(dǎo)致無法真實(shí)客觀地評(píng)價(jià)每個(gè)QTL解釋的遺傳差異。

隨著生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)等新興學(xué)科的快速發(fā)展，以及高密度IBM遺傳圖譜構(gòu)建，通過建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)來自不同試驗(yàn)QTL置信區(qū)間優(yōu)化的“元分析(Meta-analysis)”方法已廣泛應(yīng)用。王毅等[21]將收集到的127個(gè)控制玉米株高的QTL進(jìn)行優(yōu)化，獲得40個(gè)“真實(shí)”QTL。江培順等[22]整合了1994-2012年文獻(xiàn)發(fā)表的玉米產(chǎn)量性狀(穗行數(shù)、行粒數(shù)、粒重)584個(gè)QTL，采用元分析方法，確定22個(gè)穗行數(shù)、7個(gè)行粒數(shù)和44個(gè)粒重Meta-QTLs。劉紅軍等[23]通過映射不同試驗(yàn)中的340個(gè)玉米抗病QTL，采用元分析技術(shù)，在1，3，6，10號(hào)染色體上發(fā)掘5個(gè)“一致性”抗病QTL區(qū)間。

本研究系統(tǒng)整理了2006-2015年文獻(xiàn)發(fā)表的抗玉米粗縮病定位相關(guān)信息，將不同作圖群體的QTL映射到IBM2 2008 Neighbors參考圖譜上，采用元分析方法獲得了抗玉米粗縮病24個(gè)Meta-QTLs。根據(jù)Meta-QTL兩端標(biāo)記和QTL定位信息開發(fā)InDel標(biāo)記構(gòu)建以抗粗縮病玉米自交系齊319為供體親本、感粗縮病優(yōu)良自交系鄭58為受體親本的染色體單片段代換系。借助這套代換系材料，為玉米粗縮病抗性QTL位點(diǎn)精確定位、克隆以及抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及染色體單片段代換系群體的構(gòu)建

所用材料為抗粗縮病玉米自交系齊319與感粗縮病優(yōu)良自交系鄭58，以齊319為供體，鄭58為受體，通過前景選擇和背景選擇，連續(xù)回交4代，共獲得138個(gè)BC4F1株系。從2013年開始種植，3月種植于江蘇省農(nóng)科院六合實(shí)驗(yàn)田，7月收獲后在六合加代，11月種植于海南三亞繼續(xù)加代，每個(gè)株系種植3粒，行長(zhǎng)2 m，行寬40 cm，每行種3個(gè)株系共播種9粒。整體構(gòu)建方案如圖1所示：

斜體部分表示通過MAS(Marker-assisted selection)篩選。The italic body denotes the process of MAS.

1.2 抗玉米粗縮病QTL信息收集和整理

收集2006-2015年發(fā)表在國內(nèi)外主要刊物上的抗玉米粗縮病QTL相關(guān)信息，主要包括作圖群體大小、群體類型、染色體位置、LOD值、遺傳貢獻(xiàn)率、置信區(qū)間、加性效應(yīng)、遺傳圖譜標(biāo)記和遺傳距離等。對(duì)收集的QTL信息按照BioMercator 4.2軟件[24]要求格式整理，將圖譜名稱、群體大小、群體類型、QTL所在連鎖群、QTL名稱、位置、遺傳貢獻(xiàn)率、性狀、LOD值及加性效應(yīng)值載入到每個(gè)原始圖譜中。

1.3 抗玉米粗縮病QTL的映射和Meta分析

將各個(gè)原始圖譜與參考圖譜上相關(guān)標(biāo)記載入BioMercator 4.2軟件，構(gòu)建圖譜庫，通過Analyses-Map compilations-Map compilation(ConsMap)和Analyses-Map compilations-QTL projection(QTLProj)功能將每個(gè)原始圖譜中的QTL映射到參考圖譜上，建立一致性圖譜(Consensus map)；確定最小AIC值模型后，再借助Analyses-QTL meta-analyses-Meta-analysis 1/2(Veyrieras)和Analyses-QTL meta-analyses-Meta-analysis 2/2(Veyrieras)功能完成Meta分析。

1.4 Meta-QTL及相關(guān)區(qū)域InDel標(biāo)記的挖掘與開發(fā)

通過NCBI和玉米基因組數(shù)據(jù)庫收集Meta-QTL及因缺少信息而未成功映射的QTL兩端標(biāo)記序列信息，與B73 v3基因組序列(www.maizesequence.org)比對(duì)，篩選出鄭58及齊319各QTL區(qū)段的序列。通過mInDel(https：//github.com/lyd0527/mInDel)程序搜索特定區(qū)段的InDel信息。借助Primer 3[25]設(shè)計(jì)引物，利用ePCR軟件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/e-pcr/)通過在兩親本間模擬PCR擴(kuò)增進(jìn)而分析標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性[26]。

1.5 PCR擴(kuò)增和基因型檢測(cè)

對(duì)群體全部單株及親本取樣，用低溫真空干燥儀干燥及植物組織研磨器打碎后，采用Karroten試劑盒抽提葉片DNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含2 μL(50 ng/μL)模板DNA，2 μL(1 μmol/L)兩側(cè)引物，2.5 μL 10×Buffer(含 MgCl2)，2.5 μL dNTP(1 mmol/L)，1 UTaq聚合酶和15.9 μL ddH2O，上覆20 μL礦物油。94 ℃預(yù)變性3 min；35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延長(zhǎng)5 min；4 ℃保存。2%瓊脂糖凝膠上加壓120 V對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分離，溴化乙錠染色，凝膠成像儀上觀察并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗玉米粗縮病QTL相關(guān)信息收集

共搜集20余篇抗玉米粗縮病QTL定位的文獻(xiàn)[1-20]，獲得92個(gè)抗玉米粗縮病QTL相關(guān)信息，主要分布在1，2，4，5，6，7，8染色體上(表1)；以及12個(gè)因缺少加性效應(yīng)值或遺傳貢獻(xiàn)率而未成功映射的QTL定位信息。

表1 已報(bào)道的抗玉米粗縮病QTLs Tab.1 QTLs published associated with MRDD resistance in maize

2.2 抗玉米粗縮病Meta-QTLs分析

對(duì)成功映射的92個(gè)QTL進(jìn)行分析，獲得24個(gè)Meta-QTLs，遍布玉米的10條染色體，其中在第1，6，8號(hào)染色體上較為集中，分別有4個(gè)；第2染色體上各有3個(gè)，第4，5，7染色體上各有2個(gè)。另外，在第3，9，10染色體也分別有1個(gè)Meta-QTL(圖2)。

2.3 Meta-QTLs及相關(guān)區(qū)域InDel標(biāo)記的發(fā)掘與開發(fā)

利用24個(gè)Meta-QTLs兩端序列信息以及12個(gè)未成功映射QTL的位置信息與B73基因組序列比對(duì)確定其物理位置(表2，3)。根據(jù)鄭58和齊319的二代測(cè)序后的電子拼接序列在相關(guān)區(qū)段發(fā)現(xiàn)7 142個(gè)InDel位點(diǎn)，其中約有546個(gè)含有InDel位點(diǎn)的序列可用于特異引物的開發(fā)。通過試驗(yàn)篩選出在親本鄭58和齊319間有多態(tài)且能夠清晰分辨雜合個(gè)體的標(biāo)記158個(gè)，分布在第2，4，5，6，7，8，10號(hào)染色體上，根據(jù)其基因組物理位置繪制多態(tài)InDel位點(diǎn)的染色體分布圖(圖3)。

圖2 抗玉米粗縮病QTL一致性圖譜Fig.2 Consensus map of QTL for MRDD resistance

引物名稱Primersname正向引物序列Forwardprimersequence反向引物序列Reverseprimersequence染色體Chr．物理位置/bpPhysicallociIDP755GCAGTTTGCACATCTCATGCTTCTCTGGTAGACGCGAAGC15287604umc1166CGATCAGATCATACACAACCTTGCGAGGATCGATTCTTGGCGAGT115080522IDP180CATGCCAATTTCTCTCACAGCCGTTCTCTTTGTCTCCTGGC135776205IDP4441GGCGTAGTATTGTTCGAGCCGCATGTAGGCATGTAGCAGC153007367umc1919aTAAATCTGAGCCAGTCATAAGGGCAGCAGAATAAAGTACGGTAGAGGTGG1191891247umc1335ATGGCATGCATGTGTTTGTTTTACACAGACGTCGCTAATTCCTGAAAG1197106214umc1278GTCGGAGGATGATCCCCTATCTATTGCCATAGTACATGTCCGTCATTC1215259261TIDP5626AGCAGAGGACCATGAAGTGGGATCAGCAGCTTGAAGGAGG1231219002TIDP5256CCCAAAGAAACTAACTCGGCTGGTTACCTTCGGAAGAACG21559901umc1635GCTGAGCAGATCTTTCCTTGTTTCAAGGAGCAGAACTCGGAGACG28412230TIDP7075ACAATGGTGGACTCCTTTCGTGTGCCTTTAGCATCTCACG216360096umc2195CTCTCGGCTTCTTCTACACGCTACATCCTTGACGATGAAGTCGTGG219242937IDP5862TGTCAATCAGAAACAAGCGGGTAGCACAGCGACACAGAGG2219255430TIDP5264TTCTTGCTCGAAATGACGGCACATGATCCCTGAGAATGC2227039851IDP6021ATCGTCACTTCACCATCAAGCACGTGGATCAAGGTCGTAGC3161296412IDP149CCGACAAATTTGCCATATCCCTTTCAGAGCTTACCTGCCG3187107513IDP1667GTGAATACGCCGTGGAGGTTAGGCTTTAGTTCCGCACC4157583799TIDP7116AGCTTCATGTACGGAGGAGGATAACACGACCAAGCGTTCC4169587731

表2(續(xù))

表3 未成功映射QTLs位置信息Tab.3 The physical location of QTLs unprojected

2.4 染色體單片段代換系群體鑒定與獲得

以抗粗縮病玉米自交系齊319為供體親本，感病自交系鄭58為受體親本，利用上述158個(gè)InDel標(biāo)記對(duì)208個(gè)BC1F1個(gè)體檢測(cè)，當(dāng)樣本的瓊脂糖凝膠電泳條帶表現(xiàn)多態(tài)且為雙親互補(bǔ)類型的條帶時(shí)，即該位點(diǎn)存在代換片段；當(dāng)表現(xiàn)出單一條帶且與鄭58相同時(shí)，判定該InDel標(biāo)記所在區(qū)段為純合片段；當(dāng)表現(xiàn)多態(tài)且與鄭58和齊319互補(bǔ)基因型不同時(shí)，判定為外來花粉污染[27]，最后篩選出158個(gè)與雙親基因型互補(bǔ)的BC1F1種子(圖4)。連續(xù)對(duì)回交群體前景篩選，因發(fā)芽和田間管理因素導(dǎo)致部分材料缺失，對(duì)收獲的138個(gè)BC4F1個(gè)體再次前景篩選，以及通過背景篩選發(fā)現(xiàn)雜合位點(diǎn)數(shù)量多為1～3個(gè)(圖5)，代換片段覆蓋基因組長(zhǎng)度約為761.8 Mb，覆蓋率約為37.0%。

3 討論

隨著分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)對(duì)多種作物產(chǎn)量性狀遺傳改良已取得一定成果[28-30]，但由于受到數(shù)量性狀基因的表達(dá)與互作，親本及群體大小不同、環(huán)境和統(tǒng)計(jì)方法等諸多因素的差異，控制同一性狀的QTL存在差異；同時(shí)由于多采用初級(jí)群體，定位精度和重復(fù)性較差，導(dǎo)致無法真實(shí)客觀地評(píng)價(jià)每個(gè)QTL解釋的遺傳差異。因此，本試驗(yàn)在整合不同研究中抗玉米粗縮病QTL信息基礎(chǔ)上，采用Meta分析縮小QTL置信區(qū)間，提高定位的準(zhǔn)確度和有效性[31]，進(jìn)而針對(duì)Meta-QTLs區(qū)間設(shè)計(jì)引物構(gòu)建抗玉米粗縮病的染色體單片段代換系。

圖3 158個(gè)InDel標(biāo)記在染色體上的分布Fig.3 Chromosome locations of 158 InDel markers

1，2.父本和母本條帶；3～13.BC1F1群體樣本條帶；5，13.雙親互補(bǔ)條帶，其余條帶和母本一樣。1，2.Bands of a father and mother；3-13.Bands of BC1F1 generation individuals；5，13.Band of hybrids of parents，else same with mother.

圖5 32個(gè)InDel標(biāo)記在BC4F1個(gè)體上瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The electrophoresis of 32 InDel markers amplified in BC4F1 individuals

因單片段代換系是只含有1個(gè)代換片段的代換系，群體內(nèi)的任何差異是由代換片段造成的，利用其進(jìn)行遺傳分析可以排除遺傳背景的干擾，將相關(guān)基因準(zhǔn)確定位在染色體上。朱金燕等[32]以廣陸矮4號(hào)為受體和日本晴為供體的85個(gè)染色體片段代換系系為試驗(yàn)材料，對(duì)水稻穗粒數(shù)鑒定，檢測(cè)到27個(gè)控制穗粒數(shù)的QTL。陳春俠等[33]基于59份染色體單片段代換系純合體對(duì)玉米百粒質(zhì)量性狀進(jìn)行2年6個(gè)試驗(yàn)環(huán)境的表型鑒定，共檢測(cè)出20個(gè)百粒質(zhì)量QTL，分布在玉米的8條染色體上。陶亞軍等[34]利用秈稻品種廣陸矮4號(hào)為受體和粳稻品種日本晴為供體構(gòu)建的84個(gè)染色體單片段代換系群體為材料，共檢測(cè)到36個(gè)堊白相關(guān)QTL，其中堊白度QTL 19個(gè)。

在染色體單片段代換系構(gòu)建過程中，為提高構(gòu)建效率，前期使用盡可能多的標(biāo)記對(duì)適當(dāng)大小群體進(jìn)行篩選，并選擇背景恢復(fù)率高的單株[35]。本研究通過對(duì)抗粗縮病相關(guān)位點(diǎn)挖掘的158個(gè)InDel標(biāo)記對(duì)208個(gè)BC1F1樣本進(jìn)行篩選，進(jìn)而通過多次回交建立一套單片段代換系。借助構(gòu)建的這套代換系材料可對(duì)玉米粗縮病抗性QTL精細(xì)定位和克隆，研究某個(gè)QTL位點(diǎn)效應(yīng)值的大小和不同QTL位點(diǎn)互作對(duì)抗性的貢獻(xiàn)，區(qū)分有利的等位基因和不利的等位基因，以及對(duì)玉米粗縮病的抗病育種起到重要作用。

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Construction of Single Segment Substitution Lines Confer Resistance to Maize Rough Dwarf Disease Based on Meta-analysis

BAO Huabin1，2，LIANG Shuaiqiang2，LIN Feng2

(1.College of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.Institute of Agro-biotechnology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Agricultural Biology of Jiangsu Province，Nanjing 210014，China)

On the basis of the high-density linkage map of maize IBM2 2008 Neighbors，92 QTLs (Quantitative trait locus) associated with maize rough dwarf disease were collected and an integrated QTL map were constructed.By using Meta-analysis，24 Meta-QTLs were predicted and their physical locations were estimated through bioinformatics analysis.Based on the whole genome resequencing of two maize inbred line Qi 319 and Zheng 58，7 142 InDel loci were identified at the Meta-QTL region and 546 pairs primers were designed for PCR analysis.Finally 158 InDel markers were screened for their polymorphism between Qi 319 and Zheng 58，and distributed on chromosome 2，4，5，6，7，8，and 10，respectively.With these InDel marker assisted selection，a series of SSSLs(Single segment substitution lines) were constructed by introduce these QTLs from resistant maize line Qi 319 (Donor parent) into the susceptible line Zheng 58(Recipient parent).These SSSLs will be benefit for fine-mapping of QTLs associated with maize rough dwarf disease and also provide new resources for resistance breeding.

Maize；Maize rough dwarf disease；Meta-analysis；Chromosome single segment substitution lines

2016-06-10

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20141385)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(14)5054)

寶華賓(1989-)，男，河南焦作人，碩士，主要從事玉米遺傳育種研究。

林 峰(1978-)，男，山東聊城人，副研究員，博士，主要從事玉米遺傳育種研究。

Q78；S435

A

1000-7091(2016)06-0056-07

10.7668/hbnxb.2016.06.009