轉AtHDG11基因玉米的獲得及抗旱性鑒定

南芝潤，侯 磊，劉 霞，焦雄飛，焦改麗，吳慎杰

(1.山西省農業科學院 玉米研究所，山西 忻州 034000；2.山西省農業科學院 棉花研究所，山西 運城 044000)

轉AtHDG11基因玉米的獲得及抗旱性鑒定

南芝潤1，侯 磊1，劉 霞1，焦雄飛1，焦改麗2，吳慎杰2

(1.山西省農業科學院 玉米研究所，山西 忻州 034000；2.山西省農業科學院 棉花研究所，山西 運城 044000)

培育抗除草劑和抗旱的轉基因玉米種質，通過超聲波輔助農桿菌介導花粉非組培法將擬南芥抗旱基因AtHDG11導入玉米自交系昌7-2中，獲得轉基因植株。通過逐代除草劑篩選、分子檢測對獲得的轉基因植株進行檢測，獲得5株轉基因株系。在此基礎上，以非轉基因自交系昌7-2為對照，對5個轉基因株系進行抗旱性鑒測；對苗期和十葉期玉米植株進行干旱脅迫處理，測定轉基因植株生理活性物質和光合參數。結果表明，在干旱脅迫條件下，轉基因玉米葉片的Pro含量高于非轉基因玉米，MDA含量低于非轉基因玉米；不論在正常生長條件下還是干旱條件下，轉基因株系的光合速率和水分利用率都明顯高于對照植株；而轉基因株系的蒸騰速率和氣孔導度則明顯低于對照植株。綜合室內與田間的抗旱檢測結果表明，超聲波輔助農桿菌介導花粉的非組培轉基因方法在玉米上是可行的。將擬南芥HDG11基因導入玉米，同樣可以有效地提高玉米的抗旱性，為玉米的抗旱育種提供新的種質資源和新的轉基因方法。

玉米；抗旱性；AtHDG11；遺傳轉化

玉米是世界上三大作物之一，是主要的糧食、飼料作物和重要的工業原料。提高玉米產量一直以來都是育種家們努力的目標，然而，在植物的生長過程中，經常會面臨干旱、 澇害、 鹽堿、 高溫、 低溫、 冷害、 營養匱乏、 重金屬污染等非生物脅迫，嚴重影響了植物的正常生長和發育。在這些逆境脅迫中，干旱是最為突出的限制因素之一[1]。據統計，每年干旱導致作物減產達50%以上[2]，而玉米是對水分脅迫比較敏感的作物之一，干旱是影響玉米產量提高的重要因素之一。

AtHDG11是擬南芥HD-START 轉錄因子家族成員之一。 擬南芥中共有16個HD-START 轉錄因子，這些轉錄因子在擬南芥的正常生長發育過程中充當中心調節因子[3]。過量表達HDG11基因的轉基因植株增強了的多個特征與耐旱性相關，包括增強根系生長和降低氣孔密度。目前，該基因已在擬南芥、煙草[4]、水稻[5]、馬鈴薯[6]、高羊茅[7]、黑麥草[8]、棉花和楊樹[9]中得到證實。過量表達該基因能增強植物的干旱脅迫能力，在改善植物抗旱和耐鹽性上有很好的效果。迄今為止，尚未見轉HDG11玉米的相關研究報道。

本研究通過超聲波輔助農桿菌介導花粉非組培法，將外源基因AtHDG11導入玉米自交系中，獲得了轉基因玉米植株，證明超聲波輔助農桿菌介導花粉非組培法在玉米轉基因研究上的可行性；比較了干旱脅迫下轉基因和非轉基因玉米中的游離脯氨酸含量、MDA含量以及光合參數，初步證實來源于擬南芥的HDG11基因在玉米中同樣具備抗旱耐逆的生理功能，這對培育玉米抗旱新品種具有一定的科研參考價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以玉米(Zeamays)自交系昌7-2為受體試材；農桿菌菌株為LB4404。植物表達載體pCB2004-AtHDG11由中國科學技術大學向成斌教授提供。T-DNA區結構如圖1 所示。

圖1 質粒 pCB2004-AtHDG11的 T-DNA 區Fig.1 T-DNA region of plasmid pCB2004-AtHDG11

1.2 轉化方法

1.2.1 農桿菌的準備 攜帶pCB2004-AtHDG11質粒載體的農桿菌菌株 28 ℃懸浮培養 16～24 h 后，離心并用液體培養基(含10%～15%蔗糖)重懸稀釋至 OD600為 0.8～1.0備用。

1.2.2 花粉準備 供試玉米自交系昌7-2于7月上、中旬開花抽絲前，將其雌穗套袋隔離。待盛花期收集10：00-12：00開花的玉米花粉，于4 ℃冰箱中冷凍處理2 h。將處理過的花粉溶于經過通氣和低溫處理的濃度為10%～20%的蔗糖溶液中，超聲波處理(聲強100～200 W，工作時間為5 s，間隔6 s，工作次數6次)，處理后將花粉懸浮液稍靜置后倒掉上清液。

1.2.3 轉化處理 以農桿菌懸浮液為基因供體，以處理后的花粉為受體，以一定比例將花粉和農桿菌混合，同時加入100 μmol/L乙酰丁香酮，靜置處理5～15 min后，倒掉上清液，用細毛筆刷將沉淀的處理花粉授到植物柱頭上，并套袋掛牌標記。2 d后再重復處理1次，利用農桿菌將目的基因整合于植物基因組中。待轉化的植物籽粒成熟后收獲，在隨后的生長季播種于大田，利用篩選標記基因篩選，即可獲得轉基因植株。

1.3 轉基因玉米的鑒定

1.3.1 T0種子除草劑初步篩選 將收獲的T0玉米種子表面消毒后種植在含0.05%草胺膦的固體1/2 MS培養基上進行篩選，14 d后統計玉米的生長情況。結果顯示，轉基因植株正常生長，葉片為綠色，非轉基因植株發芽后莖尖開始褐化并停止生長，將篩選出來的陽性植株移栽到花盆中，為進一步試驗做準備。

1.3.2 PCR檢測 采用CTAB法提取轉基因玉米植株和對照植株的基因組DNA[10]。以基因組DNA為模板，用AtHDG11基因的上游引物5′-CGGTGGTG GTAGTCATCAT-3′和下游引物5′-CGCCTTTAGTAGC AACACG-3′進行基因組PCR分析，預計擴增片段大約為 1 014 bp。引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

AtHDG11基因PCR擴增程序為：94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 延伸 10 min。擴增PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，拍照。確定AtHDG11基因是否插入轉基因玉米的基因組中。

1.3.3AtHDG11在轉基因玉米中的表達分析 初步確定為陽性的T1植株，取其葉片，提取葉片總 RNA。使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。以cDNA 為模板進行 PCR擴增。

用天根公司提供的RNAprep pure Plant Kit試劑盒提取T1轉基因和非轉基因玉米葉片組織總RNA，取5 μg的總RNA，用反轉錄試劑盒(SuperRT cDNA Kit)反轉錄合成20 μL的cDNA。以cDNA為模板，用AtHDG11的上游特異引物5′-CGGTGGTGG TAGTCATCATCA-3′和下游引物5′-ACTGTGGAGG TCCTCCTGTTA-3′進行RT-PCR擴增，擴增片段預計為340 bp。考察轉基因玉米葉片中AtHDG11的轉錄水平。用GADPH為內參，擴增GADPH的cDNA所用的上游引物5′-AGCAGGTCGAGCATCTTCG-3′和下游引物5′-CTGTAGCCCACTCGTTGTC-3′，RT-PCR反應采用第一鏈cDNA作為模板，擴增內參基因用30個循環，擴增AtHDG11的cDNA也用30個循環。

1.4 轉基因玉米的苗期抗旱性鑒定

播種于花盆的T2玉米植株在正常澆水條件下長至16 d，選取大小長勢一致的5個株系進行干旱控水處理，干旱處理10 d后恢復正常澆水，分別在干旱處理的第 0，4，6，10天取相同部位的葉片進行丙二酮(MDA)、游離脯氨酸(Pro)含量的測定。Pro含量的測定采用酸性茚三酮法[11]；MDA含量的測定采用TBA法[12]。

1.5 轉基因玉米的田間抗旱性鑒定

將T2轉基因玉米種子和受體自交系種子種植于大田，在植株長到10片葉時測定植株的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)、水分利用率(WUE)。測定方法參照澤泉CI-340超輕型便攜式光合作用測定儀說明書進行。選取5個株系進行測定，每個株系測5株，設3個重復。

2 結果與分析

2.1 轉基因玉米的獲得

在玉米盛花期，利用超聲波輔助農桿菌介導花粉非組培法將外源基因AtHDG11導入受體材料自交系昌7-2中，共處理玉米雌穗500穗，獲得T0種子292粒。

2.2 轉基因玉米植株的分子鑒定

2.2.1 PCR檢測AtHDG11的玉米經草胺膦篩選后得抗性苗28株，經馴化、移栽后成活14株(圖2)。待T1抗性苗生長5～6片葉時，全部取樣并提取總DNA進行PCR檢測(圖3)。對AtHDG11基因PCR檢測結果顯示，抗性株5株呈陽性，即部分除草劑草胺膦抗性的植株是非轉基因的。這5株陽性株初步被確認為轉基因陽性株。

2.2.2 RT-PCR 檢測 為了確定AtHDG11在轉基因植株中的轉錄情況，提取葉片RNA，反轉錄獲得cDNA，利用RT-PCR對初步確定為陽性的植株進行進一步檢測。選用GADPH的表達強度為內標。從圖4可以看出，AtHDG11基因不僅被整合到玉米基因組中，而且還能正常轉錄，表達水平因株系不同而差異較大。

圖2 轉基因玉米在含0.05%草銨膦培養基上的抗性表現Fig.2 Herbicide resistance of transgenic plants suffered from 0.05% glufosinate-ammonium

M.DL2000 DNA Marker；1～5.轉基因植株；-.空白對照；CK.昌7-2；+.陽性對照(質粒 DNA)。圖4同。M.DL2000 DNA Marker；1-5.Transgenic plants；-.Blank control；CK.Chang 7-2；+.Positive control(plasmid DNA).The same as Tab.4.

圖4 T1轉基因玉米植株的 RT-PCR 檢測結果Fig.4 RT-PCR analysis of T1 transgenic plants

2.3 轉基因與對照玉米植株在干旱脅迫下MDA和Pro含量的變化

脯氨酸是植物受到逆境脅迫后產生的最常見和最有效的滲透調節物質，植物通過滲透調節作用保持細胞內的水分，避免或減輕逆境對其傷害，脯氨酸含量與植物抵抗逆境的能力成正比[13]。植物中脯氨酸含量是抗逆研究的常用指標[14]。由圖5-A可知，在干旱脅迫的每個時間段，5個轉基因株系與對照植株的Pro含量均呈上升趨勢，但是轉基因植株無論是Pro的絕對含量還是相對增加程度都明顯高于對照植株，表明轉基因玉米受到的傷害較小，具有更強的抗旱性。由圖5-B可知，對照植株與轉基因植株相比，MDA(以鮮質量計)積累量較高，說明對照植株受傷害的程度更大。表明在干旱脅迫下，轉AtHDG11基因玉米能更好地免受氧化損傷，具有更強的抗旱性。

圖5 轉基因和對照玉米植株干旱脅迫處理過程中Pro和MDA含量變化Fig.5 Chang of Pro content and MDA content in transgenic maize plants and control plants during the drought stress tolerance

2.4 干旱脅迫對玉米轉基因植株光合參數的影響

光合作用是植物體內至關重要的代謝過程，其強弱對植物的抗逆性有重要影響，因而，光合參數可以作為衡量植物抗逆性強弱的重要指標[15]。由圖 6可知，不論在正常生長條件下還是在干旱條件下，轉基因株系的光合速率和水分利用效率都明顯高于對照植株；而轉基因株系的蒸騰速率和氣孔導度則明顯低于對照植株。在整個干旱脅迫過程中，轉AtHD11株系能夠維持較高的光合速率和水分利用效率，保持較低的蒸騰速率和氣孔導度，表明轉AtHD11植株在干旱脅迫中受損傷程度較輕。

圖6 干旱脅迫對玉米葉片光合參數的影響Fig.6 Effects of drought stress on photosynthetic parameters of maize leaves

3 討論與結論

超聲波介導花粉轉化法是一個簡單易行的基因轉導方法[16]，但該方法的主要缺點之一是不能很好地轉化大片段的DNA，DNA片段越大轉化的效率越低，且遺傳穩定性越差，可能是由于DNA片段沒有自主性，不能實現外源基因自主向植物細胞轉移并且整合，導致轉化率低且遺傳穩定性較差。農桿菌作為一種天然的植物基因轉化系統，具有能夠轉移大的DNA片段、 整合位點較穩定、外源基因重排少等優點，外源基因多以單或寡拷貝整合，并能穩定遺傳，其在玉米遺傳轉化中已有很多報道[17-19]。 超聲波輔助農桿菌介導花粉的非組培轉基因方法是在超聲波介導花粉轉化法的基礎上，將沒有自主性的DNA攜帶載體替換成有自主結合能力的農桿菌，這樣既可以提高轉化大片段DNA植株的結實率、穩定性，又避免了冗長繁瑣的植物組培過程。該方法經過筆者3年的試驗研究，揭示了其可行性。2013年通過超聲波輔助農桿菌介導花粉的非組培轉基因方法，將AtHDG11基因導入玉米自交系昌7-2中，共處理500株，分5個批次；2014年處理500株，分5個批次；2015年處理300株，分3個批次。2013年得到292粒種子；2014年收獲籽粒數295粒；2015年收獲230粒種子。經PCR分析鑒定，2013年有5株表現為陽性；2014年有14株表現為陽性；2015年有28株表現為陽性。隨著技術參數的不斷改進，陽性率越來越高，從2013年的1.7%增至2015年的12%。

干旱脅迫明顯地影響了農作物的生長和生產力。因此，改進作物品種的抗旱性至關重要和緊迫，轉基因的方法已被證明可以加速作物改良[20-22]。關于AtHDG11抗旱性研究表明，轉AtHDG11基因能夠增強植物對干旱的耐受性。轉基因植株改善的多個特征與耐旱性相關，如降低轉基因植株的氣孔密度、發達的植株根系、較高水平的SOD和CAT活性等。本試驗將AtHDG11轉入玉米，獲得了具有抗旱性狀的玉米新品種。選取Pro含量、MDA含量[23-24]和光合參數這幾個與抗旱密切相關的生理生化指標，以評價轉基因植株的抗旱性，試驗結果表明，在干旱脅迫下，轉AtHDG11 玉米通過提高WUE，維持較強的光合能力，較高的脯氨酸含量和較低水平的丙二酮含量等提高了玉米的抗旱性。同時也證明超聲波輔助農桿菌介導花粉非組培法的可行性。

關于轉AtHDG11 基因在玉米干旱脅迫中的表達調控功能有待進一步研究，以明確其在玉米干旱逆境脅迫下的調控機制，為研究玉米的耐旱分子機制及基因工程提供科學依據，為培育耐旱玉米新品種奠定良好的基礎。

[1] 徐立明，張振葆，梁曉玲，等.植物抗旱基因工程研究進展[J].草業學報，2014，23(6)：293-303.

[2] 唐益苗，趙昌平，高世慶，等.植物抗旱相關基因研究進展[J].麥類作物學報，2009，29(1)：166-173.

[3] Schrick K，Nguyen D，Karlowsk W M，et al.START lipid/sterol-binding domains are amplified in plants and are predominantly associated with homeodomain transcription factors[J].Genome Biology，2004，5(6)：50-67.

[4] Yu H，Chen X，Hong Y Y，et al.Activated expression of anArabidopsisHD-START protein confers drought tolerance with improved root system and reduced stomatal density[J].Plant Cell，2008，20(4)：1134-1151.

[5] Yu L H，Chen X，Wang Z，et al.Arabidopsisenhanced drought tolerance1/HOMEODOMAINGLABROUS11 confers drought tolerance in transgenic rice without yield penalty[J].Plant Physiol，2013，162(3)：1378-1391.

[6] Ruan L，Chen L J，Chen Y H，et al.Expression ofArabidopsisHOMEODOMAINGLABROUS11 enhances tolerance to drought stress in transgenic sweet potato plants[J].Journal of Plant Biology，2012，55(2)：151-158.

[7] Cao Y J，Wei Q，Liao Y，et al.Ectopic overexpression ofAtHDG11 in tall fescue resulted in enhanced tolerance to drought and salt stress[J].Plant Cell Rep，2009，28(4)：579-588.

[8] 魏 強，宋賀玲，向成斌，等.過量表達擬南芥HD-START轉錄因子AtHDG11提高黑麥草(Loliumperenne)抗旱性的初步研究[J].植物生理學通訊，2010，46(11)：1140-1146.

[9] Yu L H，Wu S J，Peng Y S，et al.ArabidopsisEDT1/HDG11 improves drought and salt tolerance in cotton and poplar and increases cotton yield in the field [J].Plant Biotechnology Journal，2016，14(1)：72-84.

[10] 王關林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學出版社，2005：742-744.

[11] 高俊風.植物生理學實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2006：228-231.

[12] 楊 升，張華新，張 麗，等.植物耐鹽生理生化指標及耐鹽植物篩選綜述[J].西北林學院學報，2010，25(3)：59-65.

[13] 許桂芳，張朝陽.高溫脅迫對4種珍珠菜屬植物抗性生理生化指標的影響[J].中國生態農業學報，2009，17(3)：565-569.

[14] 于瑋瑋，曹 波，龍 鴻，等.新疆野蘋果幼苗對鹽脅迫的生理響應[J].華北農學報，2016，31(1)：170-174.

[15] 惠紅霞，許 興，李前榮.外源甜菜堿對鹽脅迫下枸杞光合功能的改善[J].西北植物學報，2003，23(12)：2137-2142.

[16] 孫 毅，王景雪，崔貴梅.超聲波處理花粉介導植物基因轉化方法，中國，ZL991211529[P].1999-10-19.

[17] Ishida Y，Saito H，Ohta S，et al.High efficiency transformation of maize(ZeamaysL.) mediated byAgrobacteriumtumefaciens[J].Nat Biotechno1，1996，14 (6)：745-750.

[18] Zhao Z Y，Gu W，Cai T，et al.High throughput genetic transformation mediated byAgrobacteriumtumefaciensin maize[J].Mo1 Breeding，2001，8(4)：323-333.

[19] Frame B R，Shou H，Chikwamba R K，et al.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system[J].Plant Physio1，2002，129(1)：13-22.

[20] 王昌濤，趙玉錦，李坤遠，等.農桿菌介導玉米萌動胚遺傳轉化新體系的建立[J].華北農學報，2007，22(5)：110-113.

[21] 石 薇，黃叢林，張秀海，等.采用花粉管通道法將蛋白激酶基因導入玉米自交系的研究[J].華北農學報，2011，26(4)：46-49.

[22] 張曉東，李冬梅，徐文英，等.用基因槍將除草劑Basta抗性基因與小麥HMW谷蛋白亞基基因導入小麥獲得轉基因植株[J].華北農學報，1996，12(1)：13-136.

[23] 張志方，劉 亞，任 雯，等.轉TsVP基因玉米抗旱性鑒定研究[J].生物技術進展，2013，3(3)：206-210.

[24] 朱永波，張仁和，令 鐸，等.玉米苗期抗旱性鑒定指標的研究[J].西北農業學報，2008，17(3)：143-146.

Expression of AtHDG 11 in Transgenic Maize and Drought Resistance Identification

NAN Zhirun1，HOU Lei1，LIU Xia1，JIAO Xiongfei1，JIAO Gaili2，WU Shenjie2

(1.Institute of Maize，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xinzhou 034000，China； 2.Cotton Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Yuncheng 044000，China)

The objective of this experiment is to study the production of transgenic maize with the resistance of drought stress.In this study，an expression vector containing drought resistance geneAtHDG11 was used to transform to maize elite inbred line Chang 7-2 by ultrasonic assistedAgrobacteriummediated pollen transformation method，and produced transgenic maize plants.Based on herbicid resistance，PCR analysis and transcriptional analysis，five transgenic maize lines were selected from a large number of transgenic lines.Subsequently，the inbred line Chang 7-2 was used as the nontransgenic control to analyze the drought resistance of transgenic plants.Physiological active substances and photosynthetic parameters were measured on plants at the seedling stage and 10-leaf stage in a drought stress treatment.The results showed that Pro content of transgenic maize was higher than that of the CK plants under drought stress conditions，while MDA content was lower.Both normal conditions and drought condition，photosynthetic rate and water use efficiency of transgenic lines were significantly higher than that of CK plants.And transpiration rate and stomatal conductance of transgenic lines were significantly lower than the control plants.Therefore，ultrasonic assistedAgrobacteriummediated pollen transformation method is feasible in the maize.AtHDG11 is a strong biotechnological candidate for use in efforts to produce a drought-resistance maize.This study will provide new germplasm resources and new transgenic method.

Maize；Drought resistance；AtHDG11；Transformation

2016-07-06

山西省農業科學院育種基礎項目(yyzjc1413)

南芝潤(1979-)，女，山西運城人，助理研究員，碩士，主要從事玉米轉基因育種研究。

吳慎杰(1971-)，男，山西運城人，副研究員，博士，主要從事棉花轉基因育種研究。

S332.4

A

1000-7091(2016)06-0063-05

10.7668/hbnxb.2016.06.010