老年急性白血病患者死亡相關蛋白激酶基因表達的初步觀察

牛一蒙 王亞柱 李艷

老年急性白血病患者死亡相關蛋白激酶基因表達的初步觀察

牛一蒙 王亞柱 李艷

白血病在老年人中的發病率較高,且老年人常常合并各種基礎疾病,各臟器功能退化,故預后相對較差,死亡率高。探尋老年白血病患者特異性的分子生物學異常,成為目前的研究熱點之一[1]。死亡相關蛋白激酶(DAPK)是一種由鈣離子、鈣調蛋白調節的絲氨酸、蘇氨酸激酶,是細胞凋亡的一種正性的調節因子[2-3]。動物實驗表明,DAPK能夠在腫瘤發育的早期階段抑制細胞的轉化,對于晚期轉移也有一定的效果,被認為是腫瘤的抑制劑。DAPK基因表達出現低表達或者缺失,可導致該基因CpG島的啟動子區異常甲基化,失去細胞凋亡作用,被認為是腫瘤發生發展的促進因素[4-5]。

目前國內對于DAPK基因表達在造血系統惡性腫瘤的相關研究,主要集中于全年齡段病人領域。對老年患者的相關研究,國內尚未有相關報道,本研究探討中國老年急性白血病患者中DAPK基因表達狀態,力爭為進一步揭示該基因表達在老年急性白血病臨床診療上的意義,為疾病的早期診斷及判斷預后找到新的思路與方法。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 急性白血病初發老年患者52例,年齡62～81歲，平均(68.52±3.28)歲,均來源于2011年1月到2014年9月本院門診及病房住院患者,其中急性淋巴細胞白血病(ALL)21例,急性髓細胞性白血病(AML)31例。所有患者年齡≥60歲,均參照《血液病診斷及療效標準》[6]第3版進行診斷,排除實體腫瘤繼發及骨髓異常增生綜合征(MDS)轉歸急性白血病患者。選取血象正常的非白血病老年患者10例為正常對照,年齡61～77歲,平均(67.71±5.94)歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑:Ficoll-Hypaque液購自北京鼎國生物公司。氰醌(hydroquinone)亞硫酸氫鈉(sodiumbisulfite)購自sigma公司。Wizard DNA Clean-Up System試劑盒購自promega公司。蛋白酶K、dNTP混合液、Taq酶、marker(DL20OO)、TRIzol、逆轉錄酶M-MLV等購自大連寶生物(TAKARA)公司。GeneFinder購自廈門百維信生物科技有限公司。實驗所需引物均由上海生物工程公司合成。

1.2.2 單個核細胞分離:抽取骨髓或外周血5～10 ml,肝素抗凝,經淋巴細胞Ficoll-Hypaque液分離單個細胞。

1.2.3 RNA提取及RT-PCR檢測DAPK mRNA表達:TRizol法提取RNA,溶解后采用紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度。cDNA第一鏈合成體系為25 μl,用逆轉錄酶M-MLV,OligodT以及相關試劑按說明配成適當濃度,合成cDNA。以Primer軟件設計引物,DAPK引物序列上游引物：5′-GCCTGGAGACGGAGAAGAT-3′下游引物5′-AACTCCCGTGGCTGGTAGA-3′，引物長度均為170 bp。β-actin上游引物:5′-GTGCGTGACATTAAGGAG-3′,β-actin下游引物:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCT-3′，長度均為520 bp。采用RT-PCR法擴增預處理后的RNA模本,反應條件為95 ℃預變性5 min,然后95 ℃延伸45 s,退火溫度為54 ℃ 45 s,延伸溫度為72 ℃ 45 s,擴增28個循環,72 ℃延伸5 min。擴增產物在15 g/L瓊脂糖凝膠儀上進行電泳1 h,GeneFinder染料染色,成像儀觀察并攝像。

1.3 統計學處理 應用SPSS 15.0軟件進行統計學分析處理,率和構成比的比較采用卡方檢驗。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

RT-PCR檢測結果表明,DAPK基因在10例正常對照者骨髓標本中均有表達,DAPK mRNA相對含量的表達平均值為0.92±0.18,而在老年急性白血病患者骨髓標本中可見DAPK基因表達缺失及表達水平降低,缺失率達48%(25/52),mRNA表達平均值為0.51±0.20,明顯低于正常對照者,差異有統計學意義(P<0.05)。其中52.38%(11/21)的ALL病人骨髓標本DAPK mRNA表達缺失,陽性標本表達平均值為0.53±0.20,AML病人缺失率為45.16%(14/31),表達平均值為0.45±0.21,FAB分型各亞型間缺失率差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 DAPK基因表達情況

3 討論

DAPK位于人類第9染色體的長臂q34.1,全長4293 bp。可使其底物蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化,是一類新發現的鈣離子/鈣調素依賴激酶[7]。DAPK是一個細胞凋亡正調節子,能以P19ARF依賴的方式激活p53,抑制胚胎成纖維細胞的瘤性轉化,激活caspase和導致DNA碎裂而引起細胞凋亡。為多種凋亡信號的匯合點,其表觀遺傳學如甲基化可促進其表達的缺失[8],從而抑制其促腫瘤細胞凋亡的功能。人類在多種癌癥如膀胱癌、腎癌、前列腺癌、肺癌及MDS,B細胞淋巴瘤等血液系統腫瘤中,均發現DAPK基因表達出現低表達或者缺失[9-11]。提示其與癌癥的發生發展有著密切的聯系。

本研究發現,DAPK基因在10例正常對照者骨髓標本中均有表達,DAPK mRNA相對含量為0.92±0.18,而在老年急性白血病病人骨髓標本中mRNA表達平均值為0.51±0.20,明顯低于正常對照者,差異有統計學意義(P<0.05)。其中48%(25/52)的老年急性白血病患者骨髓標本DAPK mRNA表達缺失,該結果提示DAPK基因表達發生改變是老年急性白血病的常見現象。FAB分型各亞型之間比較則無明顯差異。之前文獻報道,DAPK mRNA 全人群ALL組和AML組的表達缺失率分別是52.7%和38.9%[12],本研究提示AML組老年人群缺失率較非老年人群有所上升,考慮可能與老年患者病程長,疾病進展迅速相關,尚待進一步研究證實。

老年急性白血病患者往往提示著不良的預后[13],本研究的結果為老年急性白血病的早期診斷與治療提供了新的科研方向,因時間及試驗條件限制,尚需大樣本試驗來進一步驗證,同時,逆轉該基因表達缺失,是否可改善患者預后,尚需要對患者進一步的隨訪與觀察。

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100001遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬第一醫院干診科(牛一蒙)；血液科(王亞柱，李艷)

李艷，Email: liyan2@medmail.com.cn

R 733.7

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10.3969/j.issn.1003-9198.2016.12.023

2016-01-04)