阪崎腸桿菌檢測方法的研究進(jìn)展

文/孔祥瑞

（黑龍江立高儀器設(shè)備有限公司）

阪崎腸桿菌檢測方法的研究進(jìn)展

文/孔祥瑞

（黑龍江立高儀器設(shè)備有限公司）

阪崎腸桿菌是能夠?qū)е滦律鷥簢?yán)重疾病甚至死亡的條件致病菌。目前，該菌已經(jīng)從多種食品及環(huán)境中檢出。因此，建立快速、操作簡便、特異性好、靈敏度高的檢測方法對(duì)食品及加工環(huán)境的安全監(jiān)控具有非常重要的意義。研究了國內(nèi)外阪崎腸桿菌檢測方法的進(jìn)展情況，建立快速、簡便、靈敏度高的阪崎腸桿菌檢測系統(tǒng)是未來發(fā)展的需要。

阪崎腸桿菌；檢測方法；研究進(jìn)展

阪崎腸桿菌是以日本細(xì)菌學(xué)家Riichi Sakazakii的名字命名的，是腸桿菌科腸桿菌屬的一個(gè)新種，屬于革蘭氏陰性桿菌，至2006年該菌已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了16 個(gè)生物型。該菌廣泛存在于自然界中，在奶粉、肉制品、谷物、蔬菜、水果等多種食品中分離出了阪崎腸桿菌。此菌是一種條件致病菌，感染對(duì)象多是嬰兒，尤其是早產(chǎn)、低重兒和免疫力低下的新生兒[1]。它可引起新生兒腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎等重疾，雖發(fā)病率不高，但死亡率可達(dá)到50%～80%。根據(jù)疾病預(yù)防控制中心（CDC）報(bào)告，全球每年約有6 例阪崎腸桿菌報(bào)告病例，其中大部分感染病例發(fā)生在發(fā)達(dá)國家。國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)阪崎腸桿菌的安全監(jiān)控研發(fā)了大量的檢測方法。與其它食源性致病菌相比，阪崎腸桿菌的常規(guī)檢測方法不夠成熟，對(duì)于該菌的鑒定是以 TSA 平板上產(chǎn)生的黃色素為基礎(chǔ)，只有在 TSA 平板上產(chǎn)生了黃色素，才能夠進(jìn)行下一步的一系列確認(rèn)試驗(yàn)[2]。然而，黃色素的產(chǎn)生并不是該菌所特有的，研究表明，自然界中存在一些其它菌也可以產(chǎn)生黃色素，因此該方法特異性差。因此，研究建立阪崎腸桿菌快速、特異性和靈敏度高，并且經(jīng)濟(jì)高效的檢測方法十分重要。

1 傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法

1.1 常規(guī)檢驗(yàn)方法

傳統(tǒng)的食品中阪崎腸桿菌的檢測方法是GB 4789.40-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》，此法與ISO方法相似，包括選擇性前增菌、分離、生化鑒定，檢測步驟比較復(fù)雜，周期較長，需要5～7天才能得到結(jié)果，不利于檢測該菌對(duì)食品的污染情況，且準(zhǔn)確性和特異性不高，容易導(dǎo)致結(jié)果假陽和假陰性。

1.2 常規(guī)方法的改進(jìn)

為了避免出現(xiàn)假陽和假陰性的結(jié)果，同時(shí)提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，研究人員改進(jìn)了分離培養(yǎng)基。Leuschner等[3]在培養(yǎng)基中加入4-甲基傘形酮-α-D-葡萄糖苷作為熒光底物，阪崎腸桿菌在生長繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，從而提高特異性。Muytjens等[4]鑒定了 129 株阪崎桿菌分離株的α-葡萄糖苷酶活性，100%為陽性株。在培養(yǎng)基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚-α，D-吡喃葡糖苷作為α-葡萄糖苷酶指示劑，開發(fā)了新的分離培養(yǎng)基。Leuschner和Bew[5]對(duì) ISO檢測方法稍作修改，對(duì)阪崎腸桿菌進(jìn)行篩檢，在歐洲8 個(gè)國家的16 個(gè)實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行驗(yàn)證。阪崎腸桿菌在NA+α-MUG平板上生長，在日光下菌落呈現(xiàn)鮮黃色，在紫外光下呈現(xiàn)藍(lán)/紫色熒光。可疑菌落用API20E進(jìn)行生化鑒定。

2 分子生物學(xué)方法

2.1 PCR 檢測技術(shù)

P C R技術(shù)已經(jīng)在生命科學(xué)的許多領(lǐng)域有應(yīng)用，包括單重PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)。Lehner 等[6]用PCR技術(shù)對(duì)15 株阪崎腸桿菌進(jìn)行檢測。Keyser等[7]2003年評(píng)估厭氧污泥床技術(shù)處理葡萄酒廠廢水能力時(shí)，首次報(bào)道了阪崎腸桿菌快速 PCR檢測法。高旗利等[8]對(duì)菌體16S和23S rDNA保守序列通用引物的利用，對(duì) 6 株阪崎腸桿菌16～23S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增、測序，建立奶粉中該菌PCR檢測法。PCR技術(shù)靈敏度高、快速[9]，但需要的儀器設(shè)備昂貴、電泳繁瑣，對(duì)檢測人員的技術(shù)要求較高。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是Notomi等[10]在2000年開發(fā)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，此法靈敏度高、耗時(shí)短、方法簡便[11～12]。胡連霞等[13]采用改良的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，快速檢測出嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌。Hu等[14]對(duì)阪崎腸桿菌的16S～23S rRNA基因區(qū)間設(shè)計(jì)引物，用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)阪崎腸桿菌人工污染的奶粉進(jìn)行檢測，結(jié)果表明此法靈敏度、特異性都高于PCR技術(shù)。

2.3 核酸探針技術(shù)

德國Vermicon AG公司利用核酸探針技術(shù)，設(shè)計(jì)了細(xì)菌rRNA特殊區(qū)域熒光標(biāo)記，建立了商品化檢驗(yàn)及鑒定系統(tǒng)。Lehner等[15]根據(jù)德國Vermicon AG公司建立的系統(tǒng)，使用落射熒光顯微鏡可觀察到阪崎腸桿菌發(fā)出的特異性紅光，使該菌非常容易被鑒定。Liu等[16]設(shè)計(jì)了10 對(duì)寡聚核苷酸探針和2 對(duì)特異性PCR引物。試驗(yàn)結(jié)果表明，PCR方法和探針法用于阪崎腸桿菌檢測時(shí)均為陽性。

3 免疫學(xué)檢測方法

3.1 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附是把免疫學(xué)和現(xiàn)代測試技術(shù)相結(jié)合而建立的一種超微量測定方法。石曼[17]初步研究了阪崎腸桿菌的免疫分析方法，制備了高效價(jià)、高特異性的阪崎腸桿菌多克隆抗體。通過優(yōu)化免疫分析條件，建立一種快捷、方便且實(shí)用的間接酶聯(lián)免疫檢測阪崎腸桿菌的方法。汪琳等[18]制備了抗阪崎腸桿菌單克隆抗體，并初步建立了ELISA檢測方法。

3.2 免疫磁性微球珠富集技術(shù)

金燕飛等[19]利用陽離子磁珠捕捉乳粉中的阪崎腸桿菌，將特異的阪崎腸桿菌多克隆抗體結(jié)合到磁珠微球上，磁珠捕獲同時(shí)富集細(xì)菌，此法大大縮短阪崎腸桿菌檢測周期，提高效率，與傳統(tǒng)法相比，操作簡單、靈敏度高、檢測周期短，但是成本有所增加。

3.3 免疫熒光技術(shù)

支援等[20]采用熒光生物標(biāo)記物標(biāo)記免疫磁珠富集的阪崎腸桿菌，其中熒光生物標(biāo)記物為量子點(diǎn)。結(jié)果顯示整個(gè)檢測過程只需要2 小時(shí)，檢出限較低，約為100 CFU/mL，且時(shí)間短、靈敏度高、特異性好。

4 計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)模擬智能計(jì)算系統(tǒng)

Iversen等[21]利用計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的智能計(jì)算系統(tǒng)和多層感知器ANN技術(shù)，對(duì)阪崎腸桿菌分離株的生化特征和16S rDNA序列進(jìn)行分析。以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的分析方法可降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜性和維數(shù)，提高菌種鑒定系統(tǒng)速度及可靠性。

5 小結(jié)

快速、操作簡便、靈敏度高、特異性高的檢測技術(shù)是食品中病原性微生物檢測的主要發(fā)展方向。國內(nèi)外大量的阪崎腸桿菌研究數(shù)據(jù)表明，PCR技術(shù)是未來阪崎腸桿菌快速檢測方法的研究基礎(chǔ)和方向。

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孔祥瑞（1982-），女，本科，研究方向?yàn)槿橹破窓z測化驗(yàn)。

2017-06-20）