內質網途徑在硫酸黏菌素致PC12細胞凋亡中的作用

黃 鑫，蔣 紅?，王宏軍，李繼昌，陳 磊，馬加峰

（1.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121001；2.東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030；3.遼寧省興城市藥王動物衛生監督所，遼寧 興城 125100；4.遼寧省錦州市義縣留龍溝動物衛生監督所，遼寧 義縣 121100）

內質網途徑在硫酸黏菌素致PC12細胞凋亡中的作用

黃 鑫1，蔣 紅1?，王宏軍1，李繼昌2，陳 磊3，馬加峰4

（1.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121001；2.東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030；3.遼寧省興城市藥王動物衛生監督所，遼寧 興城 125100；4.遼寧省錦州市義縣留龍溝動物衛生監督所，遼寧 義縣 121100）

為了探究內質網途徑在硫酸黏菌素誘導PC12細胞凋亡中的作用。取對數生長期PC12細胞,用含0、62.5、125、250 μg/mL硫酸黏菌素的DMEM培養液作用24 h，透射電鏡觀察PC12細胞凋亡，Western blot法檢測GnRP78、caspase-12、Caspase-3蛋白表達量，Fluo-3/AM檢測細胞內[Ca2+]i濃度變化，鈣測定試劑盒檢測細胞外[Ca2+]i濃度變化。與對照組相比，125、250 μg/mL硫酸黏菌素劑量組PC12細胞出現典型凋亡現象，使PC12細胞內[Ca2+]i濃度，GnRP78、caspase-12、Caspase-3蛋白表達量顯著升高（P＜0.01）；細胞外[Ca2+]i濃度顯著降低（P＜0.01），具有劑量-效應關系。說明通過內質網途徑介導的PC12細胞凋亡可引發硫酸黏菌素的神經毒性。

硫酸黏菌素；PC12細胞；細胞凋亡；內質網途徑

“超級細菌”是對所有抗生素有抗藥性的細菌的統稱，包括多重耐藥性（MDR）的細菌和“泛耐藥性”（pan-drug resistance,PDR）細菌。這些細菌的耐藥質粒能輕易地從一種細菌跳到另一種上面，對抗幾乎所有的抗生素，一旦“超級細菌”在全球散播，將面臨抗生素作廢的時代，危害巨大。目前如美國等歐美國家用于治療多重耐藥革蘭氏陰性細菌黏菌素感染的有效的抗微生物藥物中就有黏菌素[1-3]。硫酸黏菌素（colistin sulfate）為黏菌素的硫酸鹽，在20世80年代后期，由于黏菌素對腎臟和神經有一定的毒性作用，因而限制了黏菌素的應用，被其他具有低微的腎毒性和神經毒性的抗生素所取代[4-5]。由于研發新藥時間長，所以新型抗生素暫未被研發出來，而黏菌素能切實有效的殺滅多重耐藥革蘭氏陰性菌，迫使獸醫研究人員對黏菌素的臨床應用價值進行了再次的認識和重新評價[6-7]。但因神經毒性問題仍然存在，所以明確其毒性機制為尋找新的減毒措施指導臨床用藥具有重要意義。本文選用被廣泛用于神經生物學和神經毒理學研究的體外模型大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞（PC12細胞）[8-9]為研究對象，結合前期研究成果，從內質網途徑探討硫酸黏菌素誘導PC12細胞凋亡的神經毒性機制，為硫酸黏菌素的應用提供理論參考，以便于硫酸黏菌素在臨床上更好的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 大鼠腎上腺嗜鉻骨髓瘤細胞（PC12細胞），DMEM（Gibco），胎牛血清（四季青），蛋白抽提-RIPA裂解液、GnRP78、caspase-12、Caspase-3多抗、β-actin單抗、Fluo-3/AM、BCA試劑盒，鈣離子試劑盒（凱基生物），硫酸黏菌素、N',N’-亞甲雙丙烯酰胺（Sigma）；丙烯酰胺、甘氨酸（Ameresco），其他試劑均為國產分析純；上述均由博士德生物代購。

1.1.2 儀器 Nikon-1B倒置式生物顯微鏡（日本Nikon公司）；FA2004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；Bio-Rad iMarkTM型酶標檢測儀、Fluoroskan Ascent熒光分光光度計和二氧化碳培養箱（上海一恒公司）；Sigma低溫高速離心機（美國sigma公司）； GEM-1200ES型透射電子顯微鏡（日本電子公司）；Bio-Rad電泳儀（美國BIO-RAD公司）；WD-9413C凝膠成像系統（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養及處理 選擇培養瓶內PC12細胞，以覆滿瓶底80%～90%，處于對數生長期，細胞形態飽滿，光澤好的先懸浮細胞，離心，臺盼藍染色計數，接種于6孔板，細胞密度為1×106個/mL，置于二氧化碳培養箱內培養至細胞貼壁后，分別添加硫酸黏菌素（無血清的DMEM稀釋藥液），使硫酸黏菌素終濃度為0、62.5、125、250 μg/mL，放入二氧化碳培養箱，繼續培養24 h，備用[10]。

1.2.2 透射電鏡觀察 染毒與分組處理同1.2.1。收集細胞，前固定用2.5%戊二醛2 h，后固定用2%的四氧化鋨1.5 h，離心，中間均用冷的PBS緩沖液（pH 7.2）沖洗。用50%、70%、90%酒精依次脫水，100%酒精脫水2次。置換時先用體積比為1∶1的無水乙醇和100%丙酮，時間10 min，再用無水丙酮，時間5 min。包埋時先以1∶1體積比的無水丙酮與環氧樹脂812（Epon 812）混合滲透組織，4 000 r/min離心收集細胞。用吹風機揮發無水丙酮1 h，Epon 812包埋，經聚合、修塊和超薄切片機切片，染色時，先用4%醋酸雙氧鈾再用檸檬酸鉛，兩者染色的時間均為15 min，電鏡下觀察超微結構。

1.2.3 Western blot法檢測胞漿內GnRP78、caspase-12、Caspase-3蛋白表達 染毒與分組處理同1.2.1。處理結束后，收集細胞至離心管，冷PBS漂洗，按照博士德生物有限公司的蛋白抽提-RIPA裂解液操作說明加入裂解液，冰上裂解40 min。冷凍離心機12 000 r/min離心20 min，收集上清，分裝后于-80℃保存。BCA法測定蛋白含量，調整每份樣品的濃度為30μg/mL，設3個重復，加入加樣緩沖液煮樣后，進行SDS-PAGE蛋白電泳，100 v，90 min，用Bio-Rad電泳儀采用三明治夾心法濕轉，100 v，2 h，轉移結束，取硝酸纖維素膜，用TBST略洗，封閉液（5%TBST脫脂奶粉液）封閉1 h，TBST洗膜3次；再分別添加抗體，Gn-RP78、caspase-12、Caspase-3這三種為多克隆抗體，β-actin為單克隆抗體，稀釋時多克隆抗體均用5%TBST脫脂奶粉液1∶200稀釋，單克隆抗體按照1∶400稀釋，4℃孵育過夜，TBST洗3次膜；將對應GnRP78、caspase-12、Caspase-3這三種為多克隆抗體的膜放入以封閉液1∶1 000稀釋的山羊抗兔IgG中，對應β-actin抗體的膜放入1∶1 000稀釋的山羊抗鼠IgG中，震蕩孵育1 h，TBST洗3次膜。ECL顯影，膠片曝光，定影并晾干，用WD-9413C凝膠分析儀拍照，Image J軟件分析條帶灰度值[7]。

1.2.4 硫酸黏菌素對PC12細胞內[Ca2+]i濃度的影響 染毒與分組處理同1.2.1。經過處理的細胞，棄去上面的培養液，加入無血清培養液，輕晃后再棄去，重復2次。在暗室中加入用無血清培養液稀釋的5 μmol/L鈣熒光指示劑Fluo-3/AM，錫紙包裹，放入二氧化碳培養箱，孵育50 min，使細胞負載Fluo-3。孵育結束后，在暗室中將細胞轉移至熒光分光光度計專用96孔黑板，將雙波長熒光分光光度計的激發波長和發射波長分別調整為488 nm和525 nm，使用機器讀板，所得樣品熒光值記為F，加入0.1% Triton X-100后，測得樣品熒光值記為Fmax，再加入5 mmol/L EGTA，測得樣品熒光值記為Fmin[7]，按下面公式求出[Ca2+]i：

Kd值在37℃為400 nmol/L。每個樣本測定后均需減去自發熒光后再進行計算。

1.2.5 硫酸黏菌素對PC12細胞培養液中[Ca2+]i濃度的影響 染毒與分組處理同1.2.1。收集不同濃度硫酸黏菌素處理后的細胞上清液，按照鈣試劑盒說明操作，計算培養液中[Ca2+]i：

1.2.6 統計分析 統計分析所用的軟件是SPSS 17.0軟件，選擇其中的比較均值中單因素方差分析（AVONA）對數據進行分析。各組數據以均值±標準差表示，角標*表示數據差異顯著（P＜0.05），角標**表示數據差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 電鏡下PC12細胞超微結構Fig.1 Ultrastructure of PC12 cells treated with colistin sulfate in electron microscope

2 結果與分析

2.1 電鏡觀察結果 透射電鏡下觀察PC12細胞超微結構結果如圖1所示。對照組PC12細胞膜及細胞核被膜清晰完整，光滑，細胞核大，細胞核里面的染色質均勻分布。隨著劑量的增加，細胞核逐漸變小，并向邊緣靠攏，核里面的染色質呈團塊狀，逐漸濃縮；基質中從62.5 μg/mL硫酸黏菌素劑量組開始出現空泡，到125 μg/mL和250 μg/mL硫酸黏菌素劑量組有片狀空腔演化為空泡化；125 μg/mL和250 μg/mL硫酸黏菌素劑量組線粒體嵴逐漸斷裂、腫脹、溶解、模糊甚至消失，內質網間隙變寬，大量核糖體釋放，凋亡小體逐漸增多。

2.2 Western bblloott法檢測胞漿內GGnnRRPP7788、ccaass--ppaassee--1122、casppaassee-- 33蛋白表達結果 由圖2～5可知，經125、250 μg/mL硫酸黏菌素處理24 h后的PC12細胞，能促進內質網伴侶蛋白GnRP78、caspase-12、caspase-3表達水平極顯著增高（P＜0.01），且變化的趨勢較為接近，并存在劑量依賴關系，由此說明硫酸黏菌素能通過內質網通路誘導PC12細胞凋亡。

2.3 硫酸黏菌素對PPCC1122細胞內[[CCaa22++]]ii濃度影響 硫酸黏菌素對PC12細胞內[Ca2+]i濃度影響如圖6所示。

圖2 GnRP78、caspase-12、caspase-3蛋白表達的結果Fig.2 Result of colistin sulfate on the express of GnRP78,caspase-12,caspase-3 in PC 12 cells

圖3 GnRP蛋白表達水平Fig.3 The express level of GnRP78 in PC 12 cells

圖4 caspase-12蛋白表達水平Fig.4 The express level of caspase-12 in PC 12 cells

圖5 caspase-3蛋白表達水平Fig.5 The express level of caspase-3 in PC 12 cells

圖6 硫酸黏菌素對PC12細胞內[Ca2+]i濃度的影響Fig.6 Effect of colistin on intracellular free Ca2+concentration in PC12

由圖6能明確看出，以對照組為參比，隨著硫酸黏菌素濃度增加，可使PC12細胞內的[Ca2+]i濃度極顯著升高。

2.4 硫酸黏菌素對PPCC1122細胞外[[CCaa22++]]ii濃度影響 硫酸黏菌素對PC12細胞外[Ca2+]i濃度影響如圖7所示。與對照組相比，經硫酸黏菌素處理24h后，隨著硫酸黏菌素濃度增加，可使PC12細胞外的[Ca2+]i濃度極顯著降低。

3 討論

神經細胞內鈣離子不僅能調節神經細胞的損傷、修復和神經元的興奮性，還能在神經細胞凋亡中起至關重要的作用[7，11]。在靜息狀態下，神經細胞外鈣離子濃度等同于細胞內質網和線粒體的鈣離子濃度，比細胞胞漿內鈣離子濃度高10 000倍；為了維持細胞內外鈣離子環境的穩定狀態，需要借助細胞質膜上鈣的轉運（包括受體門控通道和電壓依賴性鈣通道）及細胞內鈣池的調控，這兩方面的協同作用使細胞內的鈣離子泵出細胞外，以保持鈣穩態。當面臨外來刺激或機體病態時，才會出現大量鈣離子從胞外流入胞內，鈣穩態被破壞，失去原有的平衡，導致鈣超載，引發神經毒性。細胞內高濃度的鈣離子可激活多種酶和鈣依賴蛋白，這些酶和蛋白的激活，可使內質網上caspase-12被釋放并激活，從而激活caspase-3，導致caspase依賴性凋亡的發生，因而細胞內Ca2+濃度升高，被認為是凋亡的始動因素[7]，目前已經通過試驗證實了細胞內鈣離子濃度的增加是凋亡的誘發因素之一，Ca2+在神經細胞凋亡中起重要作用[12-14]。本試驗可知，250 μg/mL和125 μg/mL硫酸黏菌素處理組的PC12細胞內[Ca2+]i濃度極顯著增加，PC12細胞外[Ca2+]i濃度極顯著降低，說明硫酸黏菌素能改變細胞內外鈣離子平衡關系，使細胞鈣穩態失衡。

圖7 硫酸黏菌素對PC12細胞外[Ca2+]i含量影響Fig.7 Effect of colistin on extracellular free Ca2+concentration in PC12

在內質網腔中，有HSP70家族分子伴侶即內質網伴侶蛋白GnRP78（Bip），在靜息狀態下，GnRP78與跨膜蛋白ATF6、Irel和PERK在內質網中以結合狀態存在，在電鏡觀察結果中可見內質網間隙變寬，說明硫酸黏菌素的刺激可以使內質網釋放鈣離子，導致胞漿內[Ca2+]i濃度升高，由此引發非折疊蛋白反應（UPR），導致GnRP78蛋白的含量升高，余留的GnRP78蛋白與折疊錯誤蛋白結合，使ATF6、Irel和PERK這三個蛋白解離。于是這三個蛋白將各自或協同啟動凋亡信號途徑[7，15]。硫酸黏菌素使鈣穩態失衡是內質網進入非折疊蛋白反應的誘因，可導致PC12細胞內GnRP78增多。GnRP78變多，促使Bip/ GnRP78-procaspase-12-caspase-7解體，分成三個獨立部分，其中caspase-7釋放增加，可對caspas-12前體作用，使其促進caspas-12的活化，從而誘發下游的caspase-9活化，caspase-9又可以激活caspase-3，從而誘導細胞凋亡的發生[16-17]。本試驗結果表明硫酸黏菌素可使細胞鈣穩態失衡，導致GnRP78的表達極顯著升高，使caspase-12蛋白表達水平增加，最終使caspase-3被激活而使細胞凋亡發生，說明硫酸黏菌素通過內質網途徑誘導PC12細胞凋亡。

4 結論

硫酸黏菌素通過內質網途徑誘導PC12細胞凋亡，是其神經毒性的機制之一，該研究為預防和控制硫酸黏菌素的神經毒性提供了基礎資料和理論依據。

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The effect of endoplasmic reticulum pathway of apoptosis induced by colistin sulfate in PC12 cells

Huang Xin1,Jiang Hong1*,Wang Hongjun1,Li Jichang2,Chen Lei3,Ma Jiafeng4
(1.Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001; 2.Northeast Agricultural University,Heilongjiang Harbin 150030; 3.Xingcheng city Yaowang animal health supervision,Liaoning Xingcheng 125100; 4.Yixian Liulonggou animal health supervision,Liaoning Yixian 121100)

In order to explore the effect of endoplasmic reticulum pathway of colistin sulfate induced apoptosis in PC12 cells.PC12 cells were treated with colistin sulfate dissolved in the DMEM for 24 h,whose final concentrations were 0,62.5,125 and 250μg/mL respectively.The apoptosis was detected by transmission electron microscopy.Expression of GnRP78,caspase-12,Caspase-3 protein was detected by western blotting.Intracellular and extracellular free Ca2+concentration in PC12 cells was detected by Fluo-3/AM and Kit.Compared with control group,125 μg/mL, 250μg/mL colistin sulfate could appear typical characteristics of apoptosis in PC12 cells,significantly increase(P＜0.01).Intracellular free Ca2+concentration and the expression of GnRP78, caspase-12,Caspase-3 protein,extracellular free Ca2+concentration significantly reduce(P＜0.01). The results showed that the apoptosis induced by endoplasmic reticulum pathway was neurotoxicity mechanisms caused by colistin sulfate.

Colistin sulfate;PC12 cell;Cell apoptosis;Eendoplasmic reticulum pathway

S859.8

B

1672-9692(2016)12-0001-07

2016-11-02

黃鑫（1994-），女，本科在讀，動物醫學專業。

蔣紅（1977-），女，博士，副教授，主要從事獸醫藥理學和毒理學研究。

遼寧省大學生創新創業項目（項目編號：201410160049）；遼寧省科學技術基金自然科學基金項目（項目編號：2014022051）。