擬診肺真菌病患者當中隱球菌抗原陽性率研究

李卓 朱龍有 安東善 吳春風

130021吉林省人民醫院呼吸科

擬診肺真菌病患者當中隱球菌抗原陽性率研究

李卓 朱龍有 安東善 吳春風

130021吉林省人民醫院呼吸科

目的：探討隱球菌抗原在擬診肺真菌病患者當中的陽性率。方法：收治擬診肺真菌病患者120例，用膠體金法測定隱球菌抗原。結果：120例患者隱球菌抗原檢測陽性率3.33%，均確診為肺隱球菌病。結論：隱球菌抗原檢測明顯提高了擬診肺真菌病患者隱球菌感染的陽性率，對肺隱球菌的快速診斷具有良好的應用前景。

隱球菌；擬診肺真菌病；抗原檢測

肺隱球菌病(PC)是由新生隱球菌及其變種感染所引起的一種亞急性或慢性肺部真菌感染性疾病[1]。其臨床表現無特異性，容易與肺炎、肺結核、肺癌等病相混淆，造成誤診。國內多個研究表明，PC占肺真菌病的第3位，原發性PC常見[2]。文獻報告，PC多發生于免疫功能低下者，尤其是AIDS/HIV患者，其發病率為6%～10%；而在正常人群中PC發病率相對較低。國內尚未發現有相關資料報告PC在擬診肺真菌病患者中發病率的研究。本文對2015年1月-2016年12月擬診肺真菌病患者120例用膠體金法測定隱球菌抗原，以進一步明確PC在擬診肺真菌病患者中的發病率。

資料與方法

2015年1月-2016年12月收治擬診肺真菌病患者120例，診斷均符合2009年肺真菌病診斷和治療專家共識的擬診標準[3]。

患者資料收集：包括人口學資料、流行病學資料、主要癥狀及體征、基礎疾病史、既往應用抗菌藥物史、糖皮質激素使用史、肺泡灌洗等實驗室檢查資料、影像學資料等。120例擬診肺真菌病患者中，男69例，女51例；平均年齡54.3歲；6例有飼養家禽史，1例有飼養鴿子史。入選前均發熱，體溫≥38℃，正在接受免疫抑制劑治療≥30 d 2例，持續應用糖皮質激素3周8例，患有AIDS4例，體內留置導管7例，有慢性基礎疾病109例(其中COPD 29例，間質性肺疾病5例，2型糖尿病44例，肝硬化3例，高血壓34例)。咳嗽、咳痰57例，痰中帶血3例。肺部可聞及濕啰音78例。肺部CT均有影像改變(多發結節31例，單發結節53例，單發片狀浸潤影5例，多發片狀浸潤影11例，間質性肺炎2例，混合病變18例)。所有患者均無腦膜炎癥狀。

主要試劑與儀器：膠體金免疫層析法試紙條為美國Immuno-Mycologics生產，美國食品藥品監督管理局(FDA)批準。

膠體金免疫層析法檢測：將1滴樣本加入無菌試管中，取40μL血清樣本混合，將隱球菌抗原檢測試紙條的插入帶沒入樣本液中，10min后讀取結果。

病原體確定診斷的陽性判斷標準：出現2個條帶(檢測條帶和對照條帶)為陽性；僅出現對照條帶為陰性；若對照條帶未出現，說明檢測無效，應重新檢測。

結 果

120例擬診肺真菌病患者中，血清隱球菌抗原檢測陽性4例，陽性率3.33%(4/120)，其中男3例，女1例。同時合并AIDS 1例，長期應用糖皮質激素1例，2型糖尿病伴器官損害2例。4例患者均無家禽飼養史。4例肺部影像表現3例為結節狀陰影，混合病變1例。其中結節狀陰影中1例為多發，2例為單發。4例患者全部在磁共振引導下行經皮肺穿刺，1例患者行氣管鏡檢查、經支氣管肺活檢及肺泡灌洗。4例經病理均證實為肺隱球菌病。膠體金免疫層析檢測的敏感度和特異性為100%。

討 論

肺隱球菌病致病菌為新型隱球菌，屬酵母菌[4]。新生隱球菌最早于1894年由意大利學者Sanfelice首次從桃汁中分離出[5]。它是一種條件致病菌，廣泛存在于自然環境中，鴿糞分離出的新生隱球菌是人類感染的最重要來源。其他禽類，如雞、鸚鵡、云雀等的排泄物亦能分離出隱球菌。但隨后的研究發現，在城市中心、房屋內塵埃中也可檢出。新生隱球菌在地球上分布廣泛，甚至通過接觸寵物貓、狗也可直接傳播。本組120例擬診肺真菌病患者中7例有家禽飼養史，但無一例確診為PC，提示基礎病引起的免疫功能異常和激素/免疫抑制劑的使用可能是這類患者的易患因素[6]。有研究顯示，肺隱球菌病免疫功能正常的宿主年發病率0.4/10萬～0.9/10萬，而對于免疫功能損害者，肺隱球菌發病率明顯升高，可達6%～10%。免疫功能低下主要包括感染艾滋病病毒、惡性腫瘤、使用免疫抑制藥物(免疫抑制劑、激素≥10 mg 3個月等)、器官移植病史、糖尿病伴有器官損害、呼吸系統基礎疾病(慢性阻塞性肺疾病、肺結核、間質性肺炎等)、粒細胞缺乏等，如出現任何一種情況，均被認為免疫功能低下。在有些患者，如高血壓、冠心病、類風濕性關節炎等基礎疾病亦有所體現[7，8]。本研究是針對擬診肺真菌病患者當中隱球菌抗原陽性率研究，入組患者篩選條件與免疫功能低下標準基本相近，故可認為肺真菌病診斷和治療專家共識所提出的宿主發病危險因素，也就是被認為免疫功能低下人群。本研究120例患者隱球菌抗原檢測陽性4例(3.33%)，經病理均確診，低于有免疫功能損害者肺隱球菌發病率的6%～10%，一方面與標本量少有關，另一方面與PC患者血清抗原檢測陽性率＜40%有關。

肺隱球菌病是一種亞急性或慢性真菌感染，屬于散發病，沒有明顯地區和種族差異，成年男性多于女性，兒童很少發病。文獻提示，中國免疫功能正常的PC患者男女比例約2.5:1[9]，與本研究男女比例3:1基本一致。

肺隱球菌侵入機體的途徑以皮膚和呼吸道最常見，對中樞神經系統的親和性較高。因肺隱球菌病臨床表現無特異性，而影像學亦無特異表現，因此臨床上容易造成誤診。那么，檢測1，3-β-D葡聚糖(G試驗)和半乳糖甘露聚糖(GM試驗)對診斷PC意義有多大？資料顯示，新型隱球菌細胞壁中含有1，3-β-D葡聚糖較念珠菌和曲霉少，且其外面包裹了較厚的莢膜，1，3-β-D葡聚糖很難釋放到血液中，所以G試驗均為陰性[10，11]。目前對于肺隱球菌病實驗室檢查內容主要是病原學檢查，主要依靠痰及血的真菌培養及墨汁染色檢查，但培養和涂片陽性率低，且痰標本易污染，標本多依靠侵襲性檢查獲得。目前主要依靠纖維支氣管鏡肺泡灌洗液、經支氣管肺活檢、經皮肺穿刺等有創性檢查來提高診斷陽性率，但有時獲取標本較難。據文獻報告經皮肺穿刺的確診率74%～95%[12-14]。因臨床上很多有創檢查患者難以接受，因此易誤診誤治，延誤病情。因此就應該尋找一種簡便、快速、有效、方便診斷隱球菌感染的實驗方法。

目前血清學診斷方法中的膠體金法無創、操作簡單，可對新型隱球菌莢多糖抗原進行半定量檢測。膠體金法是一種類似于“三明治”的夾心免疫層析試紙條試驗。樣本稀釋液和樣本加入到容器中混合，再將試紙條放入，通過毛吸作用樣本可層析至檢測膜上的金標對照抗體處和金標抗隱球菌抗原捕獲單抗處，如果樣本中有隱球菌抗原，則會與金標抗隱球菌的抗體結合，該復合物在檢測條帶處可顯示出一條可見的檢測條帶。對照條帶處固定化的抗體將與金標對照抗體結合，形成一條可見的對照條帶。陽性結果會出現2個條帶，陰性結果將僅出現1個條帶(即對照條帶)；未出現對照條帶，則該檢測無效[15]。有研究顯示，膠體金免疫層析法的敏感度95%，特異度100%[16]。甚至有研究認為，膠體金法比傳統的血清乳膠凝集試驗有更高的可信度[17]。由此可見，該檢測方法在診斷新生隱球菌感染方面具有極高的特異性和敏感性，且具有在常溫下性狀穩定、對技術要求低、操作簡單、檢測時間短、結果判定簡單等優點，能對擬診肺真菌病患者的隱球菌病早期診斷提供依據，具有較高的診斷價值。膠體金免疫層析試驗陽性，結合臨床和典型的影像學表現，可以臨床診斷肺隱球菌病[18]。部分病例連續監測結果與其病程發展相關性良好，提示該檢查對病情預測具有一定意義。本研究中，抗原陽性4例，均經病理證實為PC，敏感性及特異性亦達到100%，說明其在擬診肺真菌病患者當中進行PC篩查具有非常重要的意義。但其亦有其局限性，Vilchez等對器官移植后隱球菌感染的研究發現[19]，隱球菌腦膜炎患者腦脊液中抗原陽性率達100%，血清抗原陽性率在播散性感染為100%，隱球菌腦膜炎為86%，而單純肺部感染者為40%，約60%的單純PC患者僅僅通過血清抗原檢測是容易被遺漏的，可見提高PC診斷陽性率的同時需采取綜合檢查手段才能顯著提高診斷率。

總之，PC臨床表現不特異，診斷往往較困難。擬診肺真菌病患者人群亦屬于免疫功能低下人群，此類患者PC發病率明顯高于免疫功能正常者。有創檢查往往令患者難以接受，而膠體金免疫層析法操作簡單，在常溫下性狀穩定，檢測時間短，結果判定直觀，檢測隱球菌莢膜抗原可快速對患者進行篩查，以達到快速臨床診斷的目的。但基于其會遺漏部分PC患者，對臨床上結合病史和影像檢查高度懷疑PC而上述病原學檢查為陰性時，還應盡早進行病理活檢。

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Study on the positive rate of cryptococcal antigen in patients with suspected pulmonary mycosis

Li Zhuo,Zhu Longyou,An Dongshan,Wu Chunfeng
Department of Respiration,the People's Hospital of Jilin Province 130021

Objective:To investigate the positive rate of cryptococcal antigen in patients with suspected pulmonary mycosis.Methods:120 patients with suspected pulmonary mycosis were selected.They were determined antigen of cryptococcus by colloidal gold assay.Results:3.33%of the 120 patients were positive for cryptococcal antigen,and all of them were diagnosed as pulmonary cryptococcosis.Conclusion:The detection of cryptococcal antigen can obviously improves the positive rate of cryptococcal infection in patients with suspected pulmonary mycosis,and has a good prospect for the rapid diagnosis of cryptococcus neoformans.

Cryptococcus;Prospective pulmonary mycosis;Antigen dectection

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.33.70

吉林省衛生計生委自籌經費課題(編號：2015SZC04)

Fund projectsupported by the school of health and family planning of Jilin province(No:2015SZC04)