小黃魚魚卵的形態學及遺傳學鑒別

樊艷楠，葉振江，姜屹倩，萬 榮，任一平，于洪亮

（1.中國海洋大學水產學院，山東青島 266003；2.威海市文登區海洋與漁業局，山東威海 264400）

小黃魚魚卵的形態學及遺傳學鑒別

樊艷楠1，葉振江1，姜屹倩1，萬 榮1，任一平1，于洪亮2

（1.中國海洋大學水產學院，山東青島 266003；2.威海市文登區海洋與漁業局，山東威海 264400）

為驗證小黃魚魚卵形態學鑒別的準確性，以及CO I基因序列在小黃魚魚卵鑒別中應用的可行性，對黃海中南部近岸海域15個站位采集的兩組平行樣品分別進行傳統形態學鑒別和CO I基因片段序列的測定。形態學鑒別結果顯示，7站出現小黃魚魚卵，共計128粒。卵徑1.242～1.535 mm，油球徑0.414～0.567 mm。遺傳學鑒別結果顯示，共108個個體成功擴增并測序，共檢測到17個單倍型，與小黃魚間的遺傳距離在0.000～0.038之間；與其他石首魚科魚類序列的遺傳距離在0.112～0.317之間。Kimura雙參數模型構建的NJ系統樹聚類結果顯示，魚卵與小黃魚單倍型聚為一支，與其他石首魚科魚類序列分為不同的分支，推斷108粒魚卵均為小黃魚。對比形態學和遺傳學鑒別結果，不存在顯著差異（P=0.844>0.05）。結果表明，小黃魚魚卵的形態學鑒別具有較高的準確性，線粒體CO I基因可應用于小黃魚魚卵的鑒別。

小黃魚魚卵；CO I基因；遺傳學鑒別；形態學鑒別

魚卵的存活和數量是魚類資源補充和漁業資源持續利用的基礎[1]，因此，魚卵種類組成與數量分布的研究，對揭示魚類幼體棲息地選擇、早期補充機制，以及制訂漁業資源保護與可持續利用策略具有重要意義，而其相關研究依賴于魚類魚卵種類的準確鑒別。目前，國內外魚卵種類鑒別的方法有傳統形態學、卵膜掃描電鏡觀察、分子生物學和單克隆抗體免疫染色等[2]。傳統上，一般采用形態學方法進行魚卵種類鑒別[3]，然而由于相關種類形態學記述資料的不完備及其形態學發育過程的復雜性，魚卵形態學鑒別具有較高難度和一定的不確定性。在此背景下，遺傳學方法逐漸應用于海洋魚類卵子的準確鑒別[4-5]，以及形態學鑒別的補充、校正，或形態學相似的近緣魚種的數量比例估計[6-7]。HARADA等[8]利用魚卵形態、CO I基因和16S rRNA基因鑒別魚卵種類，以監測加利福尼亞南部海洋保護區的產卵活動。

在遺傳學鑒別的各種方法中，mtDNA序列分析作為物種準確鑒別的有效方法之一[9]，已經廣泛應用于魚類魚卵、仔稚魚種類鑒別中[10-11]。其中CO I基因片段分子結構簡單，進化速率適中，具有相對保守且足夠的變異，是鑒別魚類良好的分子標記[12-13]。柳淑芳等[13]研究結果證明CO I基因可作為DNA條形碼對石首魚科魚類進行有效的物種鑒定；彭居俐等[14]研究表明以CO I基因作為鲌屬魚類DNA條形碼進行物種鑒定具有一定的可行性。WARD等[16]通過對澳大利亞207種魚類的CO I基因序列進行分析，得到魚類CO I序列種內、屬間和科間的平均遺傳相似度分別為99.61%、90.07%和84.54%，進一步說明CO I基因序列可作為一種有效的分子標記用于物種鑒定。

小黃魚Larimichthys polyactis是我國重要的海洋經濟魚種之一，在海洋漁業中的地位十分重要，其產卵場廣泛分布于我國渤、黃、東海近岸海域，并與藍點馬鮫、棘頭梅童魚等的產卵場有較大的時空重疊[17]。小黃魚魚卵卵膜無特殊構造，卵徑范圍較大，與其他魚卵種類存在一定混淆風險，尤其是發育早期的藍點馬鮫魚卵[1,18-19]。目前，在我國應用遺傳學方法對單個魚卵進行種類鑒別的研究鮮有報道。本研究以黃海中南部近岸產卵場的魚卵為研究對象，分別進行形態學鑒別和小黃魚魚卵的線粒體CO I基因測序，以驗證CO I基因在魚卵鑒別中的應用效果，及小黃魚魚卵形態學鑒別的準確性，為我國海洋魚類早期生活史的研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年5月16日-23日期間，于黃海中南部（32°00′-35°32′N，119°45′-122°35′E）近岸海域，使用大型浮游生物網（網口內徑0.8 m，網目0.505 mm，網衣長2.8 m）在船兩側同步采樣。樣品分別用5%福爾馬林海水溶液和95%乙醇進行固定保存。網口設置水平流量計（HYDRO-BIOS）以記錄濾水量。8尾小黃魚成魚采集于青島近岸海域，取其肌肉組織浸于95%乙醇。

1.2 形態學鑒別

將5%福爾馬林海水溶液固定的樣品在室內進行分檢，參照文獻[17]和[20]，使用浮游生物計數板在江南永新JSZ5型體視顯微鏡下對魚卵樣品進行種類鑒別，隨機挑選小黃魚魚卵約100粒進行觀測并拍照。

1.3 遺傳學鑒別

將95%乙醇固定的樣品帶回實驗室進行分檢，并在體視顯微鏡下挑選出小黃魚疑似卵（卵徑1.00～1.65 mm，且具有油球），分別編號，浸于95%乙醇。

1.3.1 DNA提取

魚卵DNA提取采用Chelex-100（Bio-Rad Laboratories，US），利用吸管將魚卵用95%乙醇吹打洗凈放入離心管，用無菌牙簽挑破，加入25 μL 6%Chelex-100及0.5 μL蛋白酶（20 mg/mL），參照文獻[21-22]提取DNA。成魚肌肉組織采用DNA試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取DNA，置于-20℃保存。

1.3.2 擴增與測序

小黃魚CO I基因片段的引物為：LP-F（5’-CATAACCCAATACCAAACACCCC-3’)，LP-R(5’-GAATCAATGAAAAAATCCACCCA-3’），由華大基因科技股份有限公司合成。

PCR反應體系為25 μL，其中2×Easy Taq Mix（北京全式金生物技術有限公司）12.5 μL，正反引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板2.5 μL，ddH2O 8 μL。熱循環參數：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物送至華大基因科技股份有限公司由ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer DNA測序儀進行測序。

1.4 數據處理與分析

1.4.1 數據處理

魚卵分布密度以每100 m3水體中出現的個體數（ind/100 m3）表示。其公式[4]為：

式中，Nstd為魚卵分布密度；N為實際捕獲的魚卵數量；w為濾水量。

1.4.2 序列分析

利用DNAstar中的Seqman軟件對序列進行對比和校正，去除兩端不可信序列。利用DnaSP 5.10軟件[23]對校正后的測序結果進行單倍型統計分析。將單倍型輸入GenBank中進行BLAST搜索，并下載石首魚科魚類的同源序列，利用MEGA 4.0軟件基于Kimura 2-parameter[24]計算單倍型間的遺傳距離，構建NJ系統樹[25]，各分支的置信度采用Bootstrap（重復數為1 000）方法。

1.4.3 非參數檢驗

利用SPSS 18.0軟件對兩組平行樣品的總魚卵密度數據進行Wilcoxon符號秩檢驗，以確定所兩組樣品總魚卵密度是否存在顯著差異。若不存在顯著差異，則認為采樣誤差可以忽略，可對兩組小黃魚魚卵的形態學和遺傳學鑒別結果進行Wilcoxon符號秩檢驗，以檢驗小黃魚魚卵形態學鑒別的準確性。

2 結果

2.1 形態學鑒別結果

共采集魚卵1 278粒。其中，7站出現小黃魚魚卵，共計128粒。小黃魚魚卵為浮性卵，呈圓球形，卵膜光滑而透明，無特殊結構（圖1）。卵徑1.242～1.535 mm，主要為1.25～1.40 mm（圖2）。卵黃均勻，無龜裂，呈米黃色。具橙黃色油球1個，油球徑0.414～0.567 mm，原口關閉后，油球固定于胚體后部。當胚體圍繞卵黃1/2周時，可在胚體頭部及背部觀察到點狀黑色素（圖1）。

圖1 小黃魚魚卵Fig.1 L.polyactis eggs

圖2 2015年5月黃海中南部近岸海域小黃魚卵徑Fig.2 The frequency distribution of diameter of the L.polyactis eggs collected at the central and southern Yellow sea in May 2015

2.2 遺傳學鑒別結果

共采集魚卵658粒，在體視顯微鏡下挑出小黃魚疑似卵156粒。經PCR擴增、測序后，得到108條魚卵的CO I基因片段序列。與8條成魚的測序結果以及其他6種石首魚科魚類（表1）的CO I序列一同進行剪切、比對后得到548 bp的同源序列。

表1 基于CO I基因片段序列進行對比分析所用序列的信息Tab.1 Information of the partial sequences of CO I gene

108條魚卵CO I序列中共檢測到17個單倍型（EH1-EH17），單倍型多樣性（Hd）為0.306 5，共30個變異位點。8條成魚CO I序列共檢測到5個單倍型（H1-H5），Hd為0.857 1，共7個變異位點。其中，90個魚卵個體與3個小黃魚個體共享單倍型EH1（H4）。將魚卵的17個單倍型輸入GenBank中進行BLAST搜索，結果顯示魚卵與小黃魚序列的相似度均高于97%。采用Kimura雙參數模型估算的魚卵與小黃魚個體間的遺傳距離在0.000～0.038之間，平均遺傳距離0.003；魚卵與其他石首魚科魚類序列間的遺傳距離在0.112～0.317之間（表2）。NJ系統樹（圖3，僅顯示支持率大于50%的數據）顯示，魚卵與小黃魚單倍型明顯聚為一大支，與其他石首魚科魚類序列分為不同的分支。因此，推斷魚卵全部為小黃魚。

圖3 魚卵和石首魚科魚類CO I基因單倍型NJ樹Fig.3 The NJ tree for CO I gene haplotypes of fish eggs and the other species of Sciaenidae

2.3 形態學與遺傳學鑒別結果對比分析

對兩組平行樣品的總魚卵密度數據進行Wilcoxon符號秩檢驗，結果顯示兩組樣品在魚卵密度上不存在顯著差異（P=0.084>0.05），如圖4。因此，忽略采樣的隨機誤差，可以對兩組魚卵樣品的鑒別結果進行對比分析。結果顯示，小黃魚魚卵的形態學與遺傳學鑒別結果不存在顯著差異（P=0.884> 0.05）。

圖4 小黃魚魚卵分布密度Fig.4 The distribution densities of L.polyactis eggs

3 討論

魚卵傳統形態學鑒別主要依據魚卵的形態特征，采樣地點、采樣時間及采樣海域習見魚類種類等信息，但不同種魚類可能具有相似的魚卵形態學特征、重疊的產卵場及產卵期[26]。因此，運用形態學方法一般可將魚卵鑒別到科或屬的水平[27]，準確鑒別到種的水平存在一定困難。由于適用性等因素，目前傳統形態學鑒別方法仍作為鑒別魚卵的主要方法，mtDNA序列分析可作為一種輔助分類方法應用于魚卵、仔稚魚鑒別[28]。本試驗分別以形態學和遺傳學的方法，對兩組平行樣品進行鑒別。結果顯示，兩組小黃魚魚卵分布密度不存在顯著差異，表明小黃魚魚卵的形態學鑒別具有相對較高的準確率，利用形態學方法鑒定小黃魚魚卵可靠性較高。

采用Chelex-100樹脂法[21]提取單個魚卵DNA，操作簡單，整個提取過程均在一個離心管中進行，避免了損耗及二次污染，DNA提取效果良好，可應用于mtDNA基因PCR。以CO I基因片段為分子標記對魚卵

進行遺傳學鑒別，成功擴增出目的片段，表明遺傳學方法可用于目標魚卵的種類鑒別，與卞曉東等[12]研究結果一致。108粒魚卵與小黃魚的遺傳距離為0.000～0.038，平均遺傳距離為0.003，符合HEBERT等[28]所得出的大部分物種的種內遺傳距離小于0.010的結論。Kimura雙參數模型構建的NJ系統樹聚類結果顯示，魚卵與小黃魚單倍型聚為一支，親緣關系極近，而與其他石首魚科魚類序列分為不同分支，親緣關系較遠。經遺傳學綜合分析推斷108粒魚卵個體全部為小黃魚。研究結果表明，CO I基因序列在小黃魚種內非常保守，種間具有一定的差異，可應用于小黃魚魚卵的鑒別，是一種可靠的魚卵輔助鑒別手段。

表2 魚卵與石首魚科魚類COI基因單倍型間的遺傳距離Tab.2 Genetic distance between the haplotypes of fish eggs and the other species of Sciaenidae for CO I gene

小黃魚魚卵CO I基因單倍型多樣性為0.306 5，與成魚（Hd=0.857 1）相比多樣性較低，推測主要由以下兩個原因造成。其一，魚卵不具備游泳能力，隨波漂流。因此，同一批次的魚卵相對較為集中。然而線粒體基因遵循母系遺傳，因此同一雌性個體所產魚卵的CO I基因單倍型相同。其二，存在較大的采樣誤差。小黃魚魚卵主要采自3個站位，其數量在采樣站位間存在巨大差異。因此，不能夠很好的代表調查海域小黃魚魚卵整體的遺傳多樣性。

致謝：感謝中國海洋大學水產學院孫世春教授為本研究提供了實驗條件和指導。感謝武瑾、張曉英和居玉滿同學在實驗過程中所給予的幫助。

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Morphological and Genetic Identification of Larimichthys polyactis Eggs

FAN Yan-nan,YE Zhen-jiang,JIANG Yi-qian,et al
(College of Fisheries,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to verify the correctness of morphological identification and identify if the partial sequences of mitochondrial CO I gene can be a useful tool to identify Larimichthys polyactis eggs,the eggs which were collected at 15 stations in the central and southern Yellow sea were identified by morphological and genetic method respectively.The results of morphological identification showed that 128 L.polyactis eggs were found at 7 stations,and the diameter ranges of eggs and oil droplets were 1.242-1.535 mm and 0.414-0.567 mm respectively.The genetic identification results showed that there were 108 sequences which were identified yielding 17 haplotypes.The Kimura 2-parameter distance between fish eggs and L.polyactis was 0.000-0.038; but the distance between eggs and the other species of Sciaenidae was 0.112-0.317.The neighbor-joining(NJ) tree indicated that haplotypes of eggs and L.polyactis were assembled at the same embranchment,but the eggs were assembled at different embranchments with the other Sciaenidae spp.Therefore,the 108 fish eggs were identified as L.polyactis.According to the non-parametric test,there is no significant difference between the results of morphological and genetic identification(P=0.844>0.05).The findings of this study clarified that the traditional identification of L.polyactis eggs is relatively accurate,and mitochondrial CO I gene can be used to identify L.polyactis eggs.

Larimichthys polyactis eggs;CO I gene;genetic identification;morphological identification

S917.4

A

1008－830X(2016)05－0366－06

2016-06-30

高等學校博士學科點專項科研基金項目（20120132130001）；中央高校基本科研業務費專項資金項目（201262004；201562030）

樊艷楠（1992-），女，山西臨汾人，碩士研究生，研究方向：漁業資源.E-mail:452036094@qq.com

葉振江，副教授.E-mail:yechen@ouc.edu.cn