微生物發酵魷魚加工副產物的工藝優化

魏薇薇，姚利陽，曲有樂，聞正順

（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022）

微生物發酵魷魚加工副產物的工藝優化

魏薇薇，姚利陽，曲有樂，聞正順

（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022）

試驗以魷魚加工副產物為主要原料，輔以龍須菜，進行酵母菌、保加利亞乳桿菌發酵。以可溶性蛋白轉化率為檢測指標，通過單因素和正交試驗確定發酵的最佳條件。結果表明：（1）酵母菌發酵的最佳條件為：料水比為1∶7，碳源添加量為10%，接種量為15%，發酵時間為1 d，可溶性蛋白轉化率最高為17.56%；（2）保加利亞乳桿菌發酵的最佳條件為：料水比為1∶7，碳源添加量為12%，接種量為5%，發酵時間為2 d，可溶性蛋白轉化率最高為27.78%。通過微生物發酵,不僅解決了魷魚加工副產物的環境污染及資源浪費問題，而且還提高了魷魚加工副產物中小分子蛋白的含量，有望進一步加工成為利于消化吸收的理想生物制品。

魷魚；副產物；酵母菌；保加利亞乳桿菌；發酵

Key words:squid;byproduct;yeast;Lactobacillus bulgaricus;fermentation

在人類文明的歷史上，發酵的應用可謂歷史悠久，一方面，通過微生物發酵，食物的保質期可以延長；另一方面，發酵作用還能夠使食物的感官品質及營養價值得以提高[1-3]。酵母是一種單細胞微生物，其存在于整個自然界中，但肉眼無法看到，它是一種天然的發酵劑。研究表明，酵母能將糖發酵成酒精以及二氧化碳[4]，它作為一種兼性厭氧微生物，有著獨特的生命現象，即酵母在沒有氧氣或者有氧氣的發酵條件下都能夠存活[5]。酵母菌和系統的分類單元不一樣，它是一類真核單細胞微生物的統稱。酵母菌屬于真菌屬高等微生物，它具有分化的核膜及核仁，在其細胞內有像線粒體等相對復雜的結構[5]。酵母菌多分布在偏酸性（pH 4.5～6）及含糖量較高的環境里，其中大多數酵母菌為腐生生物，酵母菌在蔬菜表面、水果表皮及植物的葉子上分布比較廣泛，特別實在菜園、果園和葡萄園的土壤當中分布更多[6]。在人類食品工業文化不斷發展的進程中，酵母菌占據著及其重要的地位，起了不可替代的作用。目前，我們已經通過酵母菌生產出了各種各樣營養豐富的飲品及食物，如今這些食物幾乎可以說是我們餐桌上必不可少的東西，例如醋、面粉制品、醬油、各種酒類以及低醇類飲品[7-11]等。

保加利亞乳桿菌Lactobacillus bulgaricus，一種以國名稱之的細菌，在1919年它被稱為保加利亞嗜熱菌Thermobacterium bulgaricus，后來1971年又被改為乳桿菌保加利亞，之后1984年又附屬于德氏乳桿菌Lb.delbrueckii，稱作德氏乳桿菌保加利亞亞種Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus，可以看出它是典型的來自乳的乳酸菌。保加利亞乳桿菌是乳酸菌的重要組成部分，它作為一種發酵劑，廣泛應用于食品工業中酸奶的生產當中。

隨著人們對腸道微生物與健康關系的認識及研究不斷加深，另外還有悉生生物學、臨床醫學、微生物學以及食品科學[12]之間的相互滲透，使得保加利亞乳桿菌這種益生菌逐漸被人們了解和關注。保加利亞乳桿菌特殊的生理活性曾被人們廣泛地研究，主要是以發酵食品和微生態制劑[13-14]等多種形式出現。保加利亞乳桿菌能促進人體內有益菌的生長定植，可以清腸、抗腹瀉等，從而維持胃腸道健康[15-17]，還具有促進消化吸收[18]、增加免疫[19]以及抗癌抗腫瘤[20-21]等重要的生理功能，因此，保加利亞乳桿菌被規定成為能夠用于保健食品的益生菌菌種之一，并且其在飼料行業、食品發酵、工業乳酸發酵以及醫療保健領域都有廣泛地應用。

魷魚副產物是魷魚在加工生產的過程中產生的廢棄物，包括魚頭、魚骨、魚皮、內臟、魚尾等，其重量約占原料魚的20%～40%。副產物中含有豐富的蛋白質、維生素、不飽和脂肪酸及各種礦物質等多種成分[22]，如果不對其進行有效利用，將會是寶貴資源的極大浪費。因此，充分利用魚類加工副產物，不僅能提高魚類產品的附加值，而且在減少加工業污染物排放、保護環境等方面均具有重要的現實意義[23-25]。本文以魷魚加工副產物為發酵基質，結合酵母菌發酵和保加利亞乳桿菌發酵技術，以期提高魷魚副產物蛋白的利用價值，在研究發酵影響因素的基礎上，對發酵工藝條件進行優化，分析發酵前后可溶性蛋白含量的變化及其蛋白轉化率的高低，旨在為魷魚加工副產物后續的新型應用以及酵母菌發酵水產動物蛋白研究、保加利亞乳桿菌發酵水產動物蛋白研究提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酵母菌純菌種與培養基

酵母菌是湖北宜昌安琪酵母有限公司提供的，使用了兩種培養基進行培養，一種是完全培養基（用于酵母菌的活化和培養），其培養基組成包括蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、7水合硫酸鎂、硫酸亞鐵、三蒸水（以上試劑均為分析純）；另一種是發酵培養基（用于魷魚副產物的發酵試驗），其培養基組成主要包括魷魚加工副產物、水、碳源。

1.1.2 保加利亞乳桿菌菌種與培養基

乳酸菌是湖北宜昌安琪酵母有限公司提供的，該乳酸菌是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌，我們又進一步篩選分離的，分離出的保加利亞乳桿菌進行了試驗，試驗所用的乳酸菌使用了兩種培養基進行培養，一種是完全培養基，其培養基組成包括牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、檸檬酸三胺、七水硫酸鎂（以上試劑均為分析純）；另一種是發酵培養基（用于魷魚加工副產物的發酵試驗），其培養基組成主要包括魷魚加工副產物、水、碳源。

1.1.3 主要原輔料

魷魚加工副產物、葡萄糖、海藻粉（龍須菜粉末）、碳酸鈉、氫氧化鈉、無水硫酸銅、酒石酸鉀等。

1.2 儀器與設備

THZ-82B氣浴恒溫震蕩器金壇市醫療儀器廠；UV-1600型紫外分光光度計上海美譜達儀器有限公司；YC-260L 4℃冰箱；FA1004N分析天平上海民橋精密科學儀器有限公司；WF-180E超聲波清洗機寧波海曙五方超聲設備有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋國華電器有限；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；DGG-9140A型電熱鼓風恒溫干燥箱上海森信實驗儀器有限公司；TD5K離心機；DHS-20A鹵素水分測定儀上海菁海儀器有限公司；KJELTECTM8400全自動凱氏定氮儀Made in Sweden等。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

將酵母菌菌種和乳酸菌菌種分別接種到液體培養基中，接種后的各培養液在震蕩培養箱中120 r/min、28℃培養24 h后，得到初始菌液。

1.3.2 發酵工藝

將魷魚加工副產物清洗干凈，瀝水30 min，用勻漿機打碎。精密稱取2.0 g副產物勻漿，置于50 mL離心管，加入一定量的水和海藻粉。將活化后的種子培養液（調節菌數目為107）50 mL離心管，置于氣浴震蕩培養箱110 r/min發酵培養。

1.3.3 發酵溫度的確定

按l0%接種量將菌液接種至液體種子培養基中，分別于20，24，28，32，34，50℃，110 r/min搖床培養24 h，以未接種的液體培養基為對照，測定接種的液體培養基在750 nm處的OD值，確定酵母菌和保加利亞乳桿菌的最適生長溫度。

1.3.4 單因素試驗

分別進行料水比（a:b，魷魚副產物：水）、碳源添加量（a:c，魷魚副產物：海藻粉）、接種量（d:b，活化菌液水）及發酵時間[26]對發酵產物可溶性蛋白轉化率的影響試驗。

1.3.5 正交試驗設計

以料水比、碳源添加量、接種量及發酵時間4個因素為變量，設計4因素3水平正交試驗，正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗設計Tab.1 Orthogonal experimental design

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 可溶性蛋白含量測定

發酵前后物質的可溶性蛋白含量采用福林酚法[27]進行測量。

1.4.2 發酵蛋白轉化率測定

發酵蛋白轉化率測定結果根據以下公式獲得：

式中X：蛋白轉化率；M：發酵后可溶性蛋白含量；N：發酵前可溶性蛋白含量；P：魷魚副產物總蛋白含量。

2 結果與討論

2.1 發酵溫度優化

從圖1和圖2可以看出，對于酵母菌來說，它的適應溫度范圍較廣，在24～34℃之間均可正常生長，28和32℃OD值相差不大，可以定為酵母菌的最佳發酵溫度；對于保加利亞乳桿菌來說，在28℃的OD值最高，為其最佳發酵溫度。綜合酵母菌和保加利亞乳桿菌的最佳發酵溫度，將溫度定為28℃。

圖1 不同溫度下酵母菌的生長情況Fig.1 The growth of yeast at different temperature

圖2 不同溫度下保加利亞乳桿菌的生長情況Fig.2 The growth of lactobacillus bulgaricustat different temperature

2.2 酵母菌單因素及正交試驗結果

2.2.1 酵母菌單因素試驗結果

在海藻粉含量為5%，接種量為10%，發酵溫度為28℃，發酵時間1 d的條件下，料水比分別為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10，進行發酵，結果如圖3。從圖3可以看出，當料水比為1∶7和1∶10時，酵母菌發酵產物的蛋白轉化率較高，綜合考慮，料水比選擇1∶7較好。

圖3 料水比對酵母菌發酵蛋白轉化率的影響Fig.3 Effect of the ratio of material to water on protein conversion rate with yeast fermentation

在料水比為1∶5，接種量為10%，發酵溫度為28℃，發酵時間1d的條件下，碳源添加量分別為2%、5%、7%、10%、12%，進行發酵，結果如圖4。從圖4可以看出，當碳源添加量為10%和12%時，酵母菌發酵產物的蛋白轉化率變化相差不大，二者均可。

圖4 碳源添加量對酵母菌發酵蛋白轉化率的影響Fig.4 Effect of the addition of carbon source on protein conversion rate with yeast

在海藻粉含量為5%，料水比為1∶5，發酵溫度為28℃，發酵時間1 d的條件下，接種量分別為5%、7%、10%、12%、15%，進行發酵，結果如圖5。從圖5可以看出，當接種量在上升的同時，酵母菌發酵產物的蛋白轉化率先是上升，在接種量達到12%后，蛋白轉化率先是下降，再上升。可能原因是，酵母菌在達到一定數量的時候，出現競爭生長，將發酵后小分子蛋白利用較多，故其蛋白轉化率下降。

在海藻粉含量為5%，料水比為1∶5，接種量為10%，發酵溫度為28℃條件下，發酵時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，進行發酵，結果如圖6。從圖6可以看出，當發酵時間為1 d，酵母菌發酵產物的蛋白轉化率最高。

圖5 接種量對酵母菌發酵蛋白轉化率的影響Fig.5 Effect of the Inoculation amount on protein conversion rate with yeast fermentation

圖6 發酵時間對酵母菌發酵蛋白轉化率的影響Fig.6 Effect of the fermentation time on protein conversion rate with yeast fermentation

2.2.2 酵母菌正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選擇料水比、碳源添加量、接種量、發酵時間4個因素，進行3因素4水平的正交試驗，結果見表2。由表2可知：根據極差R分析，蛋白轉化率影響因素主次順序為：料水比>接種量>發酵時間>碳源添加量，即料水比是影響酵母菌發酵蛋白轉化率的重要因素，其次是接種量和發酵時間。最優組合為A3，B2，C3，D1，即發酵的最佳條件：料水比為1:7，碳源添加量為10%，接種量為15%，發酵時間為1 d。

表2 酵母菌發酵工藝正交試驗設計與結果Tab.2 Orthogonal experiment design and results of yeast fermentation process

2.3 保加利亞乳桿菌單因素及正交試驗結果

2.3.1 保加利亞乳桿菌單因素試驗結果

在海藻粉含量為5%，接種量為10%，發酵溫度為28℃，發酵時間1 d的條件下，料水比分別為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10，進行發酵，結果如圖7。從圖7可以看出，當料水比在由1∶1升到1∶10的過程中，保加利亞乳桿菌發酵產物的蛋白轉化率先是快速提高，后增長緩慢。可能原因是，隨著料水比的增加，菌濃度隨之改變，當菌濃度小于某一個值時，其發酵速度受到影響。最佳的料水比為1∶7。

在料水比為1∶5，接種量為10%，發酵溫度為28℃，發酵時間1 d的條件下，碳源添加量分別為2%、5%、7%、10%、12%，進行發酵，結果如圖8。從圖8可以看出，當碳源添加量為10%時，保加利亞乳桿菌發酵產物的蛋白轉化率最高。可是在碳源添加量為12%時，蛋白轉化率不升反降，可能原因是碳氮比的失衡影響了保加利亞乳桿菌的是生長速度。

圖7 料水比對保加利亞乳桿菌發酵蛋白轉化率的影響Fig.7 Effect of the ratio of material to water on protein conversion rate with Lb.bulgaricus fermentation

圖8 碳源添加對保加利亞乳桿菌發酵蛋白轉化率的影響Fig.8 Effect of the addition of carbon source on protein conversion rate with Lb.bulgaricus fermentation

在海藻粉含量為5%，料水比為1∶5，發酵溫度為28℃，發酵時間1 d的條件下，接種量分別為5%、7%、10%、12%、15%，進行發酵，結果如圖9。從圖9可以看出，當接種量為10%、12%和15%時，保加利亞乳桿菌發酵產物的蛋白轉化率相差不大，但在15%時，其蛋白轉化率達到最高。最佳接種量為15%。

圖9 接種量對保加利亞乳桿菌發酵蛋白轉化率的影響Fig.9 Effect of the Inoculation amount on protein conversion rate with Lb.bulgaricus fermentation

在海藻粉含量為5%，料水比為1∶5，接種量為10%，發酵溫度為28℃條件下，發酵時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，進行發酵，結果如圖10。從圖10可以看出，當發酵時間為2 d時，保加利亞乳桿菌發酵產物的蛋白轉化率最高。

圖10 發酵時間對保加利亞乳桿菌發酵蛋白轉化率的影響Fig.10 Effect of the time on protein conversion rate with Lb. bulgaricus fermentation

2.3.2 保加利亞乳桿菌正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選擇料水比、碳源添加量、接種量、發酵時間4個因素，進行3因素4水平的正交試驗，結果見表3。由表3可以看出：根據極差R分析，蛋白轉化率影響因素主次順序為：料水比>碳源添加量>接種量>發酵時間，即料水比是影響保加利亞乳桿菌發酵蛋白轉化率的重要因素，其次是碳源添加量和接種量。最優組合為A3，B3，C1，D2，即發酵的最佳條件：料水比為1∶7，碳源添加量為12%，接種量為5%，發酵時間為2 d。

表3 保加利亞乳桿菌發酵工藝正交試驗設計與結果Tab.3 The design and results of orthogonal experiment in the fermentation process of Lb.bulgaricus

2.4 討論

通過對酵母菌和保加利亞乳桿菌的單因素和正交試驗結果的進一步分析，發現酵母菌發酵產物蛋白轉化率可達到17.56%，而保加利亞乳桿菌發酵產物蛋白轉化率則高達27.78%，顯然乳酸菌發酵魷魚加工副產物的效果好于酵母菌。這可能和乳酸菌特有的某些功能有關，例如乳酸菌[28]在發酵過程中能合成各種維生素，其中B族維生素含量明顯增加。乳酸菌發酵魷魚加工副產物過程中具體什么因素提高了發酵產物的蛋白轉化率還有待進一步研究。已有研究表明，將植物性蛋白和水產動物按一定比例混合進行發酵，可以減少甚至消除植物性蛋白中限制性氨基酸對動物的影響，進而可以使氨基酸含量得以平衡，把發酵產物進一步加工成飼料，其應用價值很大完全有可能替代某些水產飼料中的魚粉[29]。微生物發酵的過程中產酶，并且降解魷魚加工副產物中的大分子蛋白是個復雜的過程，此外通過微生物發酵其發酵產物中氨基酸是如何改善的也需要進一步研究。

3 結論

（1）通過單因素和正交試驗確定了酵母菌發酵魷魚加工副產物的最佳條件：料水比為1:7，碳源添加量為10%，接種量為15%，發酵時間為1 d。在此條件下，酵母菌發酵蛋白轉化率最高為17.56%。

（2）通過單因素和正交試驗確定了保加利亞乳桿菌發酵魷魚加工副產物的最佳條件：料水比為1:7，碳源添加量為12%，接種量為5%，發酵時間為2 d。在此條件下，保加利亞乳桿菌發酵蛋白轉化率最高為27.78%。

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Optimization of Fermentation Conditions of Squid Processing Byproduct by Microbe

WEI Wei-wei,YAO Li-yang,QU You-le,et al
（School of Food and Medical of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

The fermentation was produced by Yeast and Lactobacillus bulgaricus with squid processing byproduct as the main raw material,supplemented with Seaweed powder.The optimal conditions of fermentation were determined by single factor and orthogonal experiment with the conversion ratio of soluble protein for index.Results show:(1)the optimal conditions for the fermentation of yeast were as follows:the ratio of material to water was 1:7,the added amount of carbon source was 10%,the inoculation amount was 15%,the fermentation time was 1 d,the conversion ratio of soluble protein was 17.56%;(2)the optimal conditions for the fermentation of L.bulgaricus were as follows:the ratio of material to water was 1:7,the added amount of carbon source was 12%,the inoculation amount was 5%,the fermentation time was 2 d,the conversion ratio of soluble protein was 27.78%.By microbial fermentation,which not only solves the environmental pollution and resources waste problems of the by-products from processing of squid,but also improve the contents of small molecular proteins in processing byproducts of squid.Microbial fermentation product is expected to be further processed to become the ideal biological products which are conducive to digestion and absorption.

TS254

A

1008－830X(2016)05－0410－07

2016-07-29

舟山市科技計劃項目（2016-41015）

魏薇薇（1991-），女，江蘇徐州人，碩士研究生，研究方向：海洋資源高值化利用.E-mail:1937676799@qq.com

聞正順（1982-），男，副教授，研究方向：海洋資源高值化利用、海洋天然產物與健康.E-mail:zswenmr@163.com