質譜在乳頭溢液中的應用進展

安麗營 李楊 楊斌

130021吉林大學第一醫院基因診斷中心1

130033吉林大學第三醫院乳腺外科2

質譜在乳頭溢液中的應用進展

安麗營1李楊2楊斌2

130021吉林大學第一醫院基因診斷中心1

130033吉林大學第三醫院乳腺外科2

乳頭溢液在臨床中較常見。本文就乳頭溢液的定義、產生的原因、常用乳頭溢液的檢查方法進行綜述，重點總結質譜在乳頭溢液中的應用。

乳頭溢液；檢查方法；質譜

乳頭溢液產生的原因

乳頭溢液是指乳頭自然流出液體。乳頭溢液包括生理性溢液和病理性溢液。生理性溢液是指哺乳期或產褥期乳頭自然流出的乳白色液體，如乳汁。病理性溢液是指非哺乳期或產褥期乳乳頭流出的液體。病理性溢液主要分3類，一類是乳管自身病變，囊腫或乳管上皮細胞增生，在乳管內形成一個或多個乳頭狀瘤或乳頭狀癌；一類是下丘腦垂體腺瘤，泌乳素分泌紊亂，形成溢液[1]；另一類是服用某些藥物導致溢液，如鎮靜藥、口服避孕藥等[2]。

乳頭溢液顏色

乳白色溢液：可見于生理性的乳頭溢液，即哺乳期乳頭溢液。多見于哺乳期或哺乳期過后回乳不徹底的女性。在未擴開乳管的情況下，輕輕擠壓乳房即可有乳汁產生；還可見于停止哺乳幾年后的女性，乳汁形成囊腫，擴開乳管后，可有乳汁從乳頭排出，少見于在任意年齡由于機械刺激而產生乳汁樣溢液；乳白色溢液還可見于病理性乳頭溢液，多見于停止哺乳多年，在未擴開乳管的情況下，擠壓乳房可見黏稠乳白色液體從乳頭流出，主要原因一是垂體病變導致泌乳素分泌異常增高，二是長期服用鎮靜藥、避孕藥。

有色溢液：有色溢液包括淡黃色血清樣溢液和血性溢液。有研究表明，這兩種顏色的乳頭溢液具有相同的臨床意義[3]。70%的有色溢液患者經病理診斷為乳頭狀瘤，10%的有色溢液為乳頭狀癌。

無色水樣液單孔或多孔無色水樣溢液，并不少見，多為乳管擴張所致。

乳頭溢液的檢查方法

乳腺X線照相術：乳腺X線照相術是較早的應用于乳腺的檢查，通過觀察X線片上鈣化、腫塊形態、大小和位置可查明乳頭溢液原因[4]。其優點：①快速簡單。②價格便宜。

缺點：①有一定的局限性，區分乳頭溢液良惡性的敏感度約20%～25%[5～7]，即便乳腺X線片提示乳頭溢液結果為陰性，也不能排除其是惡性的可能。②暴露于X線的劑量不可避免，多次照射會增加誘發乳腺癌癥的風險，尤其是攜帶BRCA1/2易感基因的年輕女性。③在乳腺X線照相時擠壓乳頭，給患者帶來一定的疼痛和不適。④年齡＜40歲者不建議使用，年齡在40～49歲的使用存在爭議：年輕女性的乳腺組織稠密，降低了乳腺X線照相術的敏感性。

乳腺超聲：乳腺超聲是大部分患者的首選檢查，應用較乳腺X線照相術晚。主要是通過超聲波獲得聲像圖，根據聲像圖上回聲的強度、聲影來區分乳腺的良惡性。其優點：①更加便捷。②對乳管內病理性乳頭溢液敏感性要好于乳腺X線照相術。研究表明，其敏感性約60%，特異性約75%～85%。

缺點：①不能連續探測乳管內的情況。②當周邊乳管內腫瘤較小時，不易探測到。③不能區分乳管內腫瘤的性質。

乳腺導管造影術：乳腺導管造影術早于乳腺X線照相術和乳腺超聲。通過溢液乳管注入造影劑，來探測和定位乳管內的腫瘤。其優點：①定位乳管內的腫瘤在乳管的位置。②當乳管內有腫物時，注入造影劑可縮小乳腺腺體的切除范圍。

缺點：①當溢液乳管不溢液時，無法行造影術。②造影劑會引起部分患者過敏，發生過敏反應，給患者帶來不必要的痛苦。③不能區分乳管內腫物的良惡性。

細胞涂片檢查：乳頭溢液涂片檢查是存在爭議的，現在不推薦作為常規的檢查方法。其優點：①操作過程簡單，即涂片、固定、染色。②涂片取樣是無痛的。③若圖片結果為陽性，可做出病因學的診斷。

缺點：①經研究證實其敏感性低，需重復操作，多次進行復檢[8]。②需要有經驗的細胞學專家采集樣本。③細胞學結果和乳管損傷缺乏相關性。

乳管內鏡檢查：乳管內鏡檢查技術在最近20年來發展迅速。我國在1988年從日本引進，由內鏡和放大60倍的顯示器組成，主要應用于對乳頭溢液的檢查。優點：①對乳頭溢液的患者，乳管鏡可直接從溢液的乳管開口處進入，可在直視下連續觀察乳管形態。②可明確乳管內腫物形態及深度。③可收集溢液乳管的灌洗液，行細胞學檢查。灌洗液的細胞學檢查結果與乳管鏡下觀察到的形態有關聯[9]。④對于乳管內占位病變可行活組織病理檢查。⑤通過探針定位病損乳管，縮小手術切除范圍。

缺點：乳管在常態下處于閉合狀態，擴開乳管時，部分患者感到疼痛。

質 譜

質譜又稱質譜法，是一種與光譜并列的譜學方法。質譜分析法是化合物形成離子和碎片離子，按照其質/荷比的不同進行分離測定，對其結構和成分分析的一種分析方法。其基本原理是樣品中組分在離子源中發生電離，生成不同質/荷比的帶電離子，在加速電場的作用下，形成離子束，進入質量分析器。在質量分析器中利用電場和磁場的作用，將其分別聚焦，形成質譜圖，從而確定所測物質質量。質譜的優點多，例如應用范圍廣泛、靈敏度及特異度高、所需樣品少等。質譜儀的種類很多，根據應用范圍的不同，主要包括有機質譜和無機質譜。有機質譜有氣相色譜-質譜聯用儀、液相色譜-質譜聯用儀、基質輔助激光解析飛行時間質譜儀；無機質譜有火花源雙聚焦質譜儀、感應耦合等離子體質譜儀、二次離子質譜儀，還有質譜聯合應用等多種類型。

質譜的應用范圍非常廣泛。其中質譜成像技術在生物醫學和生命科學領域中的應用技術較成熟[10]。在生物化學方面，質譜可以被用來研究多糖的結構和多糖在生物系統中的功能，尤其是在糖蛋白的分析上。在過去的10年里，質譜讓人們對糖類在生物中的作用有了更深的認識[11]。在微生物學方面，應用質譜探測微生物的代謝分子，并且應用多種質譜技術，不僅使人們在微生物分子水平上的認識更加深入，更使人們對微生物的化學世界有了前所未有的洞悉[12]。在臨床醫學方面，質譜應用于鱗狀肺癌切除術術中，用于確定切除腫瘤后瘤周組織的切除范圍。傳統的方法是以冰凍組織病理結果作為金標準，但其存在一個缺點，即復雜的分析流程。整個過程需要30～40 min。而質譜可以實時地在1 min內用少量的樣本進行檢測，其判定的準確度高達94.42%[13]。可見質譜在外科手術、治療干預上有一定的應用價值。現在質譜應用于小分子的結構分析在生命科學領域起著重要的作用。質譜是研究分子和混合物結構的標準技術。

乳管內液成分

乳腺疾病已成為全球女性非常常見的和致死性疾病，盡管現在乳腺疾病的死亡率呈下降趨勢，但是乳腺疾病的預后和治療的局限性都堪憂。所以，了解乳腺疾病在分子結構上的最初改變和發展至關重要。在這方面，乳管內液成分的改變正逐漸受到關注。乳管內液是乳管上皮細胞產生、分泌和重吸收的物質，其中含有多種成分，包括蛋白質(胰蛋白酶、血漿銅藍蛋白、前白蛋白、脂蛋白等)、免疫球蛋白(IgA、IgM、IgE、IgD)、脂肪酸、激素(催乳素、雌二醇、孕酮等)、離子(Na+、K+、Ca2+等)、細胞(上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等)[14]。

離子：鋁離子并不是人體組織中生理組成的一部分[15]，但鋁的混合物卻可以通過很多物質接觸到人體，如食品添加劑、化妝品、家用家具等。而乳腺也可以接觸到以鋁離子為主要成分的各種各樣的物質，包括飲食[16]，以及腋下使用的防汗藥[17]。很多研究者測量鋁離子在乳腺組織的含量，發現惡性腫瘤比鄰近正常組織中鋁離子的含量相對較高[18]。Mannello F等人研究得出在乳腺癌患者乳管內液中鋁離子的含量較正常乳腺或良性乳腺乳管內液中鋁離子的含量高(210 vs 125 μg/L)。在非乳腺癌患者中，乳管內液中鋁離子的含量在絕經前后無差異；但是在乳腺癌患者中，絕經后女性乳管液中鋁離子的含量較絕經前女性高[(275±33)vs(210±57)μg/L][19]。在乳腺癌患者的乳管液中除了鋁離子的含量高，炎性細胞刺激因子含量也相對較高，而在非乳腺癌患者的乳管液中則相反。而炎性反應在乳腺微環境中和乳腺癌的發生和發展的危險因素相關。可見，鋁離子在乳管內液中起著重要的作用。鐵元素是人體健康必不可少的元素之一，在體內無論含量過多還是過少都會對健康構成威脅。Ferdinando Mannello等人研究鐵在體內的平衡對乳腺微環境的影響中顯示，鐵蛋白和轉鐵蛋白在乳腺癌患者乳頭抽吸液中的含量遠遠高于非乳腺癌患者。研究還顯示，鐵在體內的平衡受鋁離子的調控，鐵蛋白和轉鐵蛋白的含量與鋁離子的積累有一定的相關性[20]。乳腺微環境中的Fe2+在AlO22-的作用下轉化成Fe3+，增加了微環境內的氧化損傷，這種氧化應激在乳腺微環境中和乳腺癌的發生和發展的危險因素相關。可見鐵離子在乳管內液中也有著重要的地位。

糖類-乳糖：乳糖存在于乳管的分泌物中被認為是乳房分泌活動的生物化學證據。Nicholas L Petrakis等人發現乳糖存在于經產婦或未生育的年輕女性的乳管液中。這一發現暗示了一些非妊娠期的婦女乳房受催乳素的刺激。因此，乳糖可以作為簡單的標記來提示乳腺的生理分泌活動[21]。乳糖是乳汁中重要的營養物質，也是具有滲透性質的物質，處于泌乳期的乳腺，乳糖的滲透作用促使人體內的水分流入乳管，增加了乳汁的體積[22]。通過乳糖的滲透作用，有研究者發現乳糖按規律的飲食攝入作為可調節的因素，可以用來改變女性乳管內的分泌。這一發現有助于乳管內液作為探測乳腺疾病的診斷依據[23]。

激素：乳腺受人體體內雌性激素水平的調節，乳腺癌和雌激素水平及狀態有關。許多研究學者發現伴隨著女性月經周期的變化，乳管內液中的雌激素含量較血清的雌激素含量高[24～28]。這是因為乳管內的上皮細胞在芳香酶和硫酸酯酶的作用下能夠合成雌激素。同時，Chatterton等人證實乳管內液中含有大量的雌激素前體物質[29]。而且，乳管內液的雌激素水平也受口服避孕藥和激素替代療法的影響。乳腺的每一個乳管的內環境是不同的。Khan等證實每一個乳管內的雌激素和雌激素前體的含量不同[30]。這也解釋了為什么一個乳頭會同時有不同顏色的溢液。

細胞：乳管的微環境由細胞外基質和各種基質細胞組成，細胞和細胞之間、細胞和細胞外基質之間相互作用。它們之間的相互作用影響乳腺的正常功能和異常病變。在正常的乳腺中乳管腔內的大部分上皮細胞和基質膜是不直接接觸的，它們之間有一層肌上皮細胞，細胞的基質包括白細胞、纖維母細胞、肌成纖維細胞、內皮細胞等。在原位導管癌的乳管中，這些肌上皮細胞顯著減少，而基質的纖維母細胞、淋巴細胞、肌成纖維細胞、內皮細胞隨著腫瘤病變程度而增多。可見，乳管微環境的變化對乳腺是有影響的[31]。

質譜在乳頭溢液中的應用

人類基因組計劃在科學的探索上逐漸趨向蛋白質的研究。最初對正常和疾病的組織使用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術2D-PAGE鑒定和區分蛋白質表達。應用這種方法檢測出在乳管抽吸液中有64種蛋白質，其中又有15種蛋白質在乳腺癌患者的血清或乳腺癌組織中呈現高表達。后來，Alexander等人將2D-PAGE和基質輔助激光解析電離質譜(MALDI)技術相結合，明確乳管抽吸液中與乳腺癌相關的蛋白質成分。但由于2D-PAGE技術需要大量的樣本和人力，因此應用于臨床存在困難。因此，用于檢測蛋白質的表達其他質譜技術逐漸被發展起來，表面增強激光解析離子化飛行時間質譜(SELDI-TOF)被應用，結合質譜分析分離復雜的蛋白質混合物。和以前的蛋白質分析技術相比，其最大的優點為能夠提供快速的蛋白質譜。SELDI這項技術優于其他的蛋白質組學研究方法，還因為其所需的原材料最少[32]，不需要用高效液相色譜或氣相色譜分離復雜的混合物。

目前SELDI-TOF技術被應用在與乳腺癌相關的乳管抽吸液中生物標識物的檢測。Sauter等人從乳管抽吸液中確定了5種差異表達的蛋白質。和健康女性的乳管抽吸液相比，這5種蛋白質離子 團 (6500、 8000、 15940、 28100 和31770)頻繁出現在乳腺癌患者的乳管抽吸液中[33]。除此之外，用這種質譜技術還可以進一步研究乳腺良性病變、乳管非典型增生、乳腺導管原位癌和炎癥乳腺癌中蛋白質的改變，有利于乳腺癌的早期診斷。

此外，Edward等人應用SELDI-TOF證明乳管液中的β-酪蛋白肽就與乳腺癌有關。β-酪蛋白肽因此可以作為檢測乳腺癌的生物標記物之一。在乳管抽吸液中有一系列的蛋白質存在，并且和乳腺癌有著密切的關系。因此，可以將乳管抽吸液中蛋白質組學作為一種非侵略性的方法來檢測與乳腺癌相關的生物學標記和乳腺癌的早期診斷。

質譜除了應用于乳管抽吸液中檢測蛋白組學，還可以檢測小分子代謝物。代謝組學是繼基因組學、蛋白質組學的另外一種研究生物代謝途徑的技術。它的特點是可以描繪人體組織或液體的小分子組成。代謝物的組成標志著生物的中點，它能夠反映一種疾病的遺傳、表觀遺傳和蛋白質組學。這是因為小分子是由蛋白質產生和修飾。使用代謝組學作為腫瘤的一種標志物是對新陳代謝在腫瘤中扮演著重要角色的認識[34]。在代謝組學中，質譜是主要的技術之一。質譜分析代謝組學的復雜之處在于，在分析之前需要氣相色譜或液相色譜分離樣本[35]。

Gregory D等人用核磁共振(NMR)和氣相色譜聯合質譜(GC-MS)的方法描述乳管抽吸液[36]，他們證明了用NMR和GC-MS獲得乳管抽吸液代謝譜的可行性和乳管抽吸液代謝譜不同于血液代謝譜。而且，希望通過研究乳管抽吸液的代謝物組成可以起到預防、診斷、治療乳腺癌的作用。

綜上所述，乳頭溢液有別于乳頭抽吸液，由于人們缺乏定期檢查的意識，往往是機體出現癥狀時才想到檢查如發現乳頭有溢液后，我們可以通過收集乳頭溢液，用色譜-質譜儀篩查乳腺癌，預測就診者患乳腺癌的風險。

目前，無論是乳頭抽吸液還是乳頭溢液都只是在試驗階段，尚未應用到臨床中。可能存在的問題：①質譜應用于乳頭抽吸液或溢液的方法尚待進一步研究。②應用質譜測生物液體的蛋白組學還是代謝組學的生物標記物尚不明確。③質譜的儀器及相關儀器價格相對較貴。希望質譜可以盡早應用于臨床檢測，在乳腺癌的預防、診斷和治療方面發揮作用。

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Advances in the application of mass spectrometry in nipple discharge

An Liying1,Li Yang2,Yang Bin2The Gene Diagnosis Center of No.1 Hospital of Jilin University 1300211
Department of Breast Surgery,the Third Hospital of Jilin University 1300332

Nipple Discharge is common in clinic.This article reviews the definition,the causes and the examination methods of nipple discharge.We focus on the summary of the application of mass spectrometry in nipple discharge.

Nipple discharge;Examination methods;Mass spectrometry

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.31.1