復(fù)方補骨脂酊高效液相色譜指紋圖譜研究

曹麗萍，劉志承，李曙光，梁 奇，江 霞，劉佳妮

（1.廣東省深圳市寶安中醫(yī)院，廣東 深圳 518133； 2.廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033；3.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808）

復(fù)方補骨脂酊高效液相色譜指紋圖譜研究

曹麗萍1，劉志承2，李曙光2，梁 奇1，江 霞2，劉佳妮3

（1.廣東省深圳市寶安中醫(yī)院，廣東 深圳 518133； 2.廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033；3.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808）

目的建立復(fù)方補骨脂酊的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，對10個不同批次的復(fù)方補骨脂酊進行質(zhì)量評價。方法色譜柱采用安捷倫TC－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），乙腈－0.2%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL／min，柱溫為35℃，檢測波長為254 nm；進樣量為10 L。結(jié)果通過測定10批復(fù)方補骨脂酊的HPLC圖譜，建立了指紋圖譜的共有模式，HPLC指紋圖譜共有峰43個，相似度為0.965～0.999；對共有峰進行了歸屬，并確認了補骨脂素、歐前胡素、丹參酮ⅡA。結(jié)論該法準確、可靠，重復(fù)性好，可為評價復(fù)方補骨脂酊的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

復(fù)方補骨脂酊；高效液相色譜法－二極管陣列檢測器；指紋圖譜；補骨脂；丹參；白芷；紅花；補骨脂素；丹參酮ⅡA；歐前胡素

復(fù)方補骨脂酊是深圳市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，方以補骨脂為君藥，溫腎助陽，外用消斑祛風(fēng)；臣以丹參活血化瘀；佐以白芷活血生肌、紅花活血養(yǎng)血。其以活血養(yǎng)血為主，達到溫通氣血、營衛(wèi)調(diào)和之功，主要用于治療白癜風(fēng)及各種白斑、斑禿、脫發(fā)。白癜風(fēng)發(fā)病機制目前仍不清楚，以補骨脂為主藥進行組方治療白癜風(fēng)的報道較多[1－2]。復(fù)方補骨脂酊臨床使用多年，醫(yī)生、患者反映療效良好，擬對其進行深度開發(fā)。該品種原質(zhì)量標準僅有補骨脂素的薄層色譜鑒別，不利于質(zhì)量控制。為此，本研究中對其指紋圖譜進行研究，為其質(zhì)量標準提高提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括SPD－M20A二極管陣列檢測器，SIL－20A自動進樣器，LC－20AT二元梯度泵，CTO－10AS柱溫箱，LC－solution色譜工作站(日本島津公司）；AUW220D型電子天平（十萬分之一，日本島津公司）；LVO－6090LC型真空干燥箱（上海龍躍儀器設(shè)備公司）；ICQ－250－DST型超聲儀（40 kHz，上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 試藥

補骨脂素、歐前胡素、丹參酮ⅡA對照品（批號分別為110739－201416，110826－201214，110766－201520），補骨脂、白芷、丹參、紅花對照藥材（批號分別為121056－200904，120945－201309，120923－201414，120907－201111），均購于中國食品藥品檢定研究院；復(fù)方補骨脂酊（深圳市中醫(yī)院制劑科自制，批號分別為20151001～20151010，編碼為 S1～S10）；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純（默克公司），其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫 TC－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈(A)－0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫（0～5 min，12%～22%A；5～17 min，22%～35%A；17～40 min，35% ～50%A；40～70 min，50% ～65%A；70～90 min，12%A）；柱溫：35℃，檢測波長：190～800 nm，流速：1 mL／min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取補骨脂素、歐前胡素及丹參酮ⅡA對照品適量，分別用甲醇溶解并定容至容量瓶中，配成單個對照品貯備液，分別精密量取各貯備液適量，置同一容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成含補骨脂素、歐前胡素、丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度分別為 41.73，10.50，41.34 μg／mL的混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照藥材溶液：取上述補骨脂等對照藥材適量，分別按供試品制備工藝制成對照藥材溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液：取S1～S10批復(fù)方補骨脂酊，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜的方法學(xué)考察

精密度試驗：取復(fù)方補骨脂酊，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，連續(xù)進樣6次。結(jié)果計算所得譜圖的相似度大于0.95，相似度的 RSD小于0.41%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取復(fù)方補骨脂酊，按2.2項下制備供試品溶液，室溫放置，分別于0，3，6，9，12，24 h時進樣，按擬訂色譜條件進樣。結(jié)果計算所得譜圖的相似度大于0.95，相似度的 RSD小于0.60%（n＝6），表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同批次復(fù)方補骨脂酊6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣。結(jié)果6份樣品所得譜圖的相似度大于0.95，相似度的 RSD小于0.46%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立和相似度計算

取10批樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，得到10批復(fù)方補骨脂酊的HPLC指紋圖譜，通過保留時間和紫外光譜圖分析，得到43個共有峰，色譜圖見圖1。采用中藥指紋圖譜相似度軟件（2004A版）對10批不同批次的復(fù)方補骨脂酊指紋圖譜數(shù)據(jù)進行處理，以中位數(shù)法多點校正生成對照指紋圖譜，建立共有模式，10批樣品與對照指紋圖譜間的相似度見表1，均大于0.90，表明10批不同樣品具有良好的相似性。

2.5 指紋圖譜定性分析

取樣品溶液、對照藥材溶液及對照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，得到色譜圖（圖2和圖3）。對共有峰進行歸屬，其中14號峰補骨脂和白芷均有貢獻，15號峰丹參和紅花均有貢獻，27，39號峰補骨脂和丹參均有貢獻，14，16～20，27～33，35，38～39，41～42號峰出自補骨脂，12～13，15，27，39，43號峰均出自丹參，13～14，21，25～26，34，36～37，40號峰出自白芷，1～11，15，22～24出自紅花，確定其中16號峰為補骨脂素，34號峰為歐前胡素，43號峰為丹參酮ⅡA。

圖1 10批復(fù)方補骨脂酊指紋圖譜色譜圖

表1 10批復(fù)方補骨脂酊的相似度

圖2 對照品溶液高效液相色譜圖

圖3 樣品高效液相色譜圖

3 討論

3.1 檢測波長選擇

中藥成分復(fù)雜，不同成分在不同波長下有最大吸收。張昀等[3]采用246 nm和260 nm切換波長測定補骨脂素等成分含量，黃超等[4]研究丹參的指紋圖譜時選擇280 nm，張翠英等[5]測白芷指紋圖譜采用檢測波長254 nm，胡燕等[6]采用檢測波長270 nm建立紅花指紋圖譜。本試驗中采用PDA檢測器在190～800 nm波長對樣品進行了全波長檢測，結(jié)合文獻，選擇不同波長下圖譜進行比較。結(jié)果顯示，254 nm波長處得到的色譜峰數(shù)目較多，信息較全面，且色譜峰分離度良好，故選擇254 nm作為檢測波長。

3.2 流動相選擇

考察了以乙腈－水、乙腈－0.2%磷酸水和甲醇－0.2%的磷酸水溶液為流動相系統(tǒng)，以不同洗脫梯度進行試驗。結(jié)果表明，乙腈－0.2%磷酸水溶液作為流動相時色譜峰分離度最好。

3.3 指紋圖譜的評價

建立的復(fù)方補骨脂酊的HPLC指紋圖譜中，共有43個共有指紋峰，各指紋峰的相對保留時間和相對峰面積較穩(wěn)定，所建立的方法有較好的重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性。將共有峰與對照藥材進行對比，確定了共有峰的歸屬，通過與對照品色譜峰比較，確定代表峰的成分。

中藥制劑成分復(fù)雜，僅通過測定其中一個或幾個有效成分的含量不能完整、全面地反映該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗中通過HPLC－PDA技術(shù)，建立了復(fù)方補骨脂酊譜指紋圖譜，并通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對其進行分析，建立了對照指紋圖譜，為復(fù)方補骨脂酊質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

[1]廖建生，劉興文，盧海燕.中藥復(fù)方白斑膏的組方原理[J].中國藥業(yè)，2008，17（14）：72－73.

[2]羅瑞雪，徐 堅.高效液相色譜法測定白癜精藥散中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].中國藥業(yè)，2005，14（4）：50－51.

[3]張 昀，劉 路.切換波長HPLC法同時測定大鼠體內(nèi)補骨脂3種有效成分[J].中國藥房，2014，25（31）：2 887.

[4]黃 超，陳科力.滇丹參與丹參脂溶性成分指紋圖譜的比較研究[J].中國藥師，2015，18（8）：1 256.

[5]張翠英，李振國，王青曉.白芷飲片HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2007，30（11）：1 374.

[6]胡 燕，王文波，宋力飛，等.紅花HPLC指紋圖譜研究[J].湖南中醫(yī)雜志，2013，29（3）：110.

Study on the HPLC Fingerprint of Compound Buguzhi Tincture

Cao Liping1,Liu Zhicheng2,Li Shuguang2,Liang Qi1,Jiang Xia2,Liu Jiani3
(1.Bao′an Chinese Medicine Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518133; 2.Dongguan Chinese Medicine Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518033; 3.Guangdong Medical College,Dongguan,Guangdong,China 523808)

Objective To establish the chromatography fingerprint of Compound Buguzhi Tincture with HPLC and to evaluate the quality of Compound Buguzhi Tincture from 10 different batches.M ethods AgilentTC－C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was used,the mobile phase was acetonitrile－0.2% orthophosphoric acid,the flow rate was 1.0 mL／min，the column temperature was 35℃，the detected wavelength was at 254 nm,and injection volume was 10 μL.Results The chromatography fingerprint of Compound Buguzhi Tincturefrom 10 different batcheswasestablished.In thechromatography fingerprint with HPLC of Compound Buguzhi Tincture, 43 common peaks were demarcated and the similarities of Compound Buguzhi Tincture were between 0.965－0.999.Psoralen,imperatorin,and tanshinoneⅡAwere identified.Conclusion The method is accurate,reliable and with good reproducibility,and can be used as the evidence for the quality evaluation of Compound Buguzhi Tincture.

compound buguzhi tincture;HPLC－PDA;fingerprint;psoraleae fructus;salviae miltiorrhizae radix et rhizoma;angelicae dahuricae radix；carthami flos;psoralen;tanshinoneⅡA;imperatorin

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)24－0024－04

曹麗萍(1986－)，女，碩士研究生，主管中藥師，研究方向為中藥學(xué)，（電話）0755－29629333（電子信箱）30137721＠qq.com；劉志承(1966－)，男，碩士研究生，主任中藥師，研究方向為中藥學(xué)，本文通訊作者，（電話）0755－83001884（電子信箱）liuzhch66＠sohu.com。

2016－01－22；

2016－08－01)