一種高效解磷復合菌劑的篩選與應用

苑偉偉+趙陽國+井永蘋+劉魯民

摘 要：通過平板透明圈和液體培養測定有效磷含量的方法初步篩選得到一株高效解磷真菌WL06，將該菌株與一株促生解淀粉芽孢桿菌WL21按照不同質量比進行復配，根據解磷復合菌劑對盆栽油菜中土壤有效磷含量和油菜長勢的影響來篩選復合菌劑配方。盆栽試驗結果表明，解磷菌WL06與促生菌WL21質量比為1∶2時解磷促生效果最好，與單一解磷菌相比，土壤有效磷含量提高66.50%，油菜鮮重提高30.76%。表明，解磷復合菌劑比單一解磷菌能夠更好地提高土壤中有效磷含量，從而促進作物對磷元素的吸收，提高作物產量和品質。

關鍵詞：解磷菌；復合菌劑；作物增長

中圖分類號：S154.39文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0086-05

Abstract Using plate and liquid culture methods to determine the available phosphorus content in liquid medium， an efficient phosphate-solubilizing fungus WL06 was screened. The fungus was mixed with a plant growth-promoting rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens WL21 in different mass ratios. Then the effects of different proportions of microbial inoculants on soil available phosphorus content and growth vigor of potted rape were investigated to screen the optimum formula. The results showed that they had the best phosphate-solubilizing and growth-promoting effects when the mass ratio of WL06 and WL21 was 1∶2. Under this formula， the soil available phosphorus content improved by 66.50% and the rape fresh weight increased by 30.76% than those of single phosphate-solubilizing fungus. This study indicated that the phosphorus-solubilizing compound inoculants had better effects on improving the soil available phosphorus than the single fungus， which would further promote the absorption of phosphorus by crop and increase crop yield and quality.

Keywords Phosphate-solubilizing bacteria； Compound microbial inoculants； Crop growth

在農業生產中，解磷菌的研究一直是關注的熱點，特別是國家“一控兩減三基本”的政策中提出，爭取到2020年實現化肥和農藥的零增長，這是生物肥料和生物農藥發展的大好時機。研究表明，土壤中難溶磷占全磷含量的98%，其中難溶有機磷源占70%（植酸鈣占68%），難溶無機磷源占28%，僅有2%左右的磷源是以植物能夠直接吸收利用的可溶性磷鹽形式存在[1]。土壤有效磷含量很低而全磷含量較高，如據黃土高原7省區的調查，土壤全磷平均較有效磷高250倍；黃淮海平原黃潮土與風沙土全磷較有效磷高130～500倍。農業中通過施入大量磷肥獲得高產，但很大一部分磷肥施入土壤后很快被土壤固定成難溶性磷化合物[2]。影響土壤中磷有效性的因素很多，其中微生物對土壤磷的轉化和利用率影響最大，解磷微生物的篩選是近些年來研究的熱點。作物根際區域是一個復雜的環境，需要多種微生物與作物根際共同作用才能完成物質的吸收和運輸過程。即使微生物將土壤中的難溶性磷解離出來變為有效態磷，有效態磷也不一定能被作物很好地吸收利用，所以不能依靠單純的解磷微生物來提高作物對磷肥的利用率，需要一種包含解磷菌和促生菌在內的復合微生物菌劑共同發揮作用，才能提高土壤中有效態磷的含量并促進作物根系的吸收利用。

本研究就是將高效解磷真菌與作物促生菌復配，制成復合微生物菌劑，在盆栽試驗中研究復合菌劑對土壤中有效磷含量及油菜生長狀況的影響，為解磷復合微生物菌劑的市場化應用和推廣提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供篩選解磷功能菌株編號為WL01～WL20，促生菌株編號為WL21。所有菌株均由青島蔚藍生物研發中心微生態實驗室分離獲得。

1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL。

無機磷培養基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g， MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2（瓊脂20 g），115℃滅菌30 min。

有機磷培養基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，植酸鈣5.0 g，蒸餾水1 000 mL， pH 7.2（瓊脂20 g），115℃滅菌30 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 固體平板初篩 將20株供試菌株接種于無機磷和有機磷固體平板培養基上，重復3次，培養3～5天，測定菌落直徑（R）及溶磷圈直徑（D），根據溶磷圈直徑與菌落直徑的比值（D/R）初步確定溶磷能力較強的菌株，用于液體培養復篩。

1.3.2 液體培養復篩 取平板初篩中溶磷能力較強的菌株，接種于PDA平板培養基30℃活化培養3天，制備孢子懸浮液，等量接種于無機磷和有機磷液體培養基中，于30℃、180 r/min培養，每天取樣離心，上清液用鉬藍比色法測定有效磷含量，連續測定7天，通過有效磷含量進一步篩選解磷效果好的菌株，用于盆栽試驗。對照為不接種菌的空白培養基。

1.3.3 盆栽試驗 供試土壤為石灰性土壤，pH值8.0，有效磷含量10.43 mg/kg，全氮0.082%。供試作物為油菜。因油菜生長對磷素比較敏感所以選擇油菜為供試作物，品種為四季青幫油菜。

將復篩得到的兩株解磷真菌WL05和WL06添加到供試土壤中，每千克土壤添加菌劑為1.0 g和2.0 g，通過評價油菜盆栽試驗中土壤有效磷變化和油菜長勢篩選較好解磷菌株及施用量。試驗分別設4個處理（表1），每處理重復3次。空白對照為不添加菌劑。

作物種子先用0.4%次氯酸鈉表面滅菌，然后用滅菌蒸餾水清洗4次除去次氯酸鈉，55℃滅菌蒸餾水浸種，30℃溫箱培養過夜，后轉入滅菌紗布催芽。播種時，接種處理每盆用菌劑2.0 g 拌種，種子表面完全粘滿菌劑，剩余菌劑與種子下方0～5 cm土壤混合均勻，然后點種。對照為不接菌處理，使用等量滅菌菌劑拌種，方法同接種處理。每盆播發芽種子5粒，出苗后每盆留苗2株。

作物生長45天后收獲，采用游標卡尺測量主根直徑，并對整株油菜稱重，評價油菜長勢；測定土壤中有效磷含量（碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法）[3]，比較解磷效果。

1.3.4 復合菌劑篩選 將盆栽試驗中復篩得到的較佳解磷菌株與促生菌株WL21，按照菌劑質量比1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3做成復合微生物菌劑，編號分別為FH1、FH2、FH3、FH4。將4種復合菌劑進行油菜盆栽試驗，并將解磷菌劑單獨作為一個處理，不添加任何菌劑的土壤為空白對照。根據土壤有效磷的變化和油菜長勢的差異評價解磷促生復合菌劑與單一解磷菌劑的功能性差異。盆栽供試土壤、作物與操作同1.3.3。

1.4 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel進行處理，利用SPSS 16.0軟件進行數據統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 固體平板培養初篩結果

通過解磷透明圈觀察，20株供試菌中有8株產生透明圈，4株D/R大于1（表2），其中菌株WL06在無機磷和有機磷培養基上產生的透明圈直徑與菌落直徑的比值分別為2.0和1.8，顯著高于WL05和WL10（P<0.05），WL01 D/R 最小，顯著低于其它菌株（P<0.05）。

2.2 液體培養復篩結果

圖1可見，固體培養初篩得到的4株菌有效磷含量在無機磷液體培養條件下逐漸增加，均在第4天達到最高，之后基本保持穩定。其中WL06有效磷含量最高，達683.19 mg/L，其次為WL05，達466.87 mg/L，WL10和WL01僅為90.27 mg/L和84.75 mg/L。因此，WL06在難溶性無機磷液體培養中解磷效果最好，其次是WL05。

4株菌有效磷含量在有機磷液體培養條件下逐漸增加（圖2），其中WL06在第6天達最高，為 186.55 mg/L，其次為WL05，在第7天最高，為98.68 mg/L，二者最高有效磷含量明顯高于WL10的59.76 mg/L和WL01的49.47 mg/L。從有效磷含量達到最高值的時間和含量綜合比較，可以看出WL06在難溶性有機磷液體培養中解磷效果最好，其次是WL05。

2.3 單菌油菜盆栽試驗效果評價

圖3可見，不同菌株及其不同用量對油菜土壤解磷能力不同，T1、T2處理為菌株WL05添加量分別為1.0 g/kg土和2.0 g/kg土，土壤有效磷含量分別達到12.72 mg/kg和16.89 mg/kg；T3、T4處理為菌株WL06添加量分別為1.0 g/kg土和2.0 g/kg土，土壤有效磷含量分別達到17.12 mg/kg和20.30 mg/kg。T4處理土壤有效磷含量顯著高于T2、T3處理，T2、T3處理顯著高于T1、CK處理。由此可見，菌株WL06添加量2.0 g/kg土的處理T4最好。

由表3中盆栽油菜鮮重、主根直徑可以看出，不同菌株不同用量對油菜長勢影響明顯。菌株WL05添加量為1.0 g/kg土和2.0 g/kg土兩個處理T1、T2的鮮重比對照分別增加7.17%和14.56%，主根直徑分別增長4.51%和12.03%。菌株WL06添加量為1.0 g/kg土和2.0 g/kg土兩個處理T3、T4的鮮重比對照分別增加15.48%和22.76%；主根直徑分別增長13.16%和37.22%。其中菌株WL06添加量為2.0g/kg土的處理T4最好，油菜的鮮重和主根直徑均顯著高于其它處理，具有顯著的促生和增產效果。

2.4 復合菌劑油菜盆栽試驗效果評價

解磷復合菌配方FH1、FH2、FH3、FH4各處理土壤有效磷含量分別為25.45、35.47、42.59、36.87 mg/kg（圖4），單一解磷菌WL06處理土壤的有效磷含量為21.30 mg/kg，由此可見，復合菌劑處理的土壤有效磷含量都比單一解磷菌劑處理高，其中配方FH3土壤有效磷含量最高，顯著高于其他處理，其次為配方FH2和FH4處理，FH1處理最低，與單一解磷菌WL06差異不顯著。

由表4中數據可以得出解磷復合菌配方FH1、FH2、FH3、FH4各處理盆栽油菜的鮮物重增長率分別達到25.70%、31.02%、55.77%、40.02%，單一解磷菌WL06的油菜鮮物重增長率為19.12%；主根直徑增長率分別達到16.67%、17.89%、28.05%、20.73%，單一解磷菌WL06的油菜主根直徑增長率為14.23%。其中配方FH3處理鮮物重和主根直徑增長率均為最高，并且與單一解磷菌差異顯著。各處理盆栽油菜的長勢見圖5，FH3處理根系圖見圖6。

3 討論

研究發現，解磷真菌的解磷效果往往好于解磷細菌。Kucey等[4]從草原土中分離的解磷真菌大多為青霉和曲霉，并證明雖然解磷真菌種類不多，但其解磷能力通常比細菌強。PDA平板上培養7天，細菌解磷能力為0.08～2.65 mg，而大部分真菌解磷能力一般是細菌的5倍，最高可達12.8 mg。林啟美等[5]也發現真菌解磷能力比細菌強，溶解磷礦粉能力較強的細菌溶磷能力為26.92～43.34 mg/kg，而大多數真菌則為59.64～145.36 mg/kg。王富民等[6]和范丙全等[7]對青霉菌（Penicillium bilaii）、曲霉菌（Aspergillus niger）解磷功能做了深入研究，發現第1茬接種青霉菌與單施磷肥的玉米和花生的生物量沒有差異，但明顯提高了花生和玉米的吸磷量，第2茬接種青霉菌顯著增加玉米、花生的生物量和吸磷量。蔡磊等[8]通過對14株細菌解磷能力篩選得到的最好解磷細菌液體培養的最高解磷量為19.10 μg/mL。本試驗中解磷真菌菌株WL06在液體培養中解無機磷能力達到683.19 mg/L，解有機磷能力達到186.55 mg/L，解磷能力較強。

在油菜盆栽試驗中，郝晶等[9]研究表明，不同解磷菌群能增加作物地上鮮重7.0%～44.4%。邢芳芳等[10]研究中施用解磷菌后雞毛菜鮮重增加32.94%。賀國強等[11]研究表明，接種解磷復合菌劑可使小麥根際土壤細菌多樣性指數和豐富度指數提高。方華舟等[12]研究表明，復合菌劑處理稻田土壤，可使土壤有效磷含量增加32.17%。賀國強等[13]研究表明，解磷復合菌劑可使小麥最高增產14.49%。與之相比，本研究應用復合菌劑后，油菜鮮重提高55.77%，表現出很好的應用效果。

4 結論

本研究篩選得到一株解磷真菌，通過與一株促生菌以1∶2的質量比復配制成的復合菌劑可使土壤中有效磷含量提高272.3%，油菜主根直徑提高28.05%，鮮重增長55.77%，比單一解磷菌具有更明顯的促生、增產效果，表現出很好的應用前景。

參 考 文 獻：

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