藍莓煤污病病原菌鑒定及防治藥劑篩選

岳清華+董克鋒+高勇+廖甜甜+胡博+姜惠鐵

摘 要：采用單孢分離法分離病原菌，并通過癥狀觀察、形態學、分子生物學、回接方法對病原菌進行鑒定，結果表明，引起藍莓煤污病的優勢病原菌有3種，即尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）、枝細枝孢（Cladosporium ramotenellum）、交鏈格孢（Alternaria alternate）。為篩選防治藍莓煤污病的有效藥劑，選擇7種殺菌劑進行田間藥效試驗，其中10%多抗霉素、500 g/L異菌脲對藍莓煤污病防治效果較好，施藥4周后相對防效分別達到78.56%、64.09%。

關鍵詞：藍莓；煤污病；病原菌鑒定；藥效

中圖分類號：S436.63文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0121-03

Abstract The pathogens of sooty mould in blueberry were isolated with single spore separation， and were conformed through symptom observation， morphological and molecular biological identification and back inoculation. The results showed that the dominant pathogens were Cladosporium oxysporum， Cladosporium ramotenellum and Alternaria alternate. To screen effective agents to control the sooty mould in blueberry， seven fungicides were selected for field efficacy trials. Among which， 10% polyoxin and 500 g/L iprodione had good effects against blueberry sooty mould， and the relative control effects reached 78.56% and 64.09% respectively after application for 4 weeks.

Keywords Blueberry； Sooty mould； Pathogenic identification； Fungicide effect

藍莓，學名越橘，杜鵑花科越橘屬（Vaccinium spp.）植物，小漿果樹種[1]。藍莓果實含有大量對人體健康有益的物質，常食對人的眼睛有良好的保健作用，還可以清除體內自由基，增強毛細血管柔韌性、預防血栓形成、抵抗泌尿系統感染、抑制癌細胞增殖等[2]。

藍莓煤污病近幾年在膠南地區藍莓園經常發生，初期癥狀為葉片、枝條上有黑色霉點，后在枝條、葉片上形成深暗綠色點狀霉層，嚴重時可連結成片，直至翌年春天。該病影響植株光合作用，樹勢衰弱。本研究對藍莓煤污病的病原菌進行了鑒定，并選擇了7種高效低毒殺菌劑進行田間試驗，為藍莓煤污病的有效防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀觀察與病原菌鑒定

于山東省膠南地區藍莓生產基地，觀察藍莓煤污病癥狀。選擇癥狀明顯的藍莓煤污病葉片，挑取煤污霉層，無菌水稀釋后采用單孢分離法[3]分離病原菌。分離后在PDA培養基上純培養，進行形態學與分子生物學鑒定。分子生物學鑒定交由第三方檢測機構上海生工生物有限公司進行鑒定并出具報告。

用分離到的病原菌孢子懸浮液做接種物，濃度為1×107個孢子/mL，選擇高20 cm的藍莓缽苗進行接種試驗。接種前先將10%濃度的蜂蜜水噴灑于藍莓葉片上，后噴灑孢子懸浮液。以清水作為對照。噴灑完成后，恒溫28℃、濕度95%以上培養觀察。

1.2 藥劑選擇與施藥方法

選擇樣地內樹體大小一致、煤污黑斑程度基本相近的樹作為試驗對象。選擇7種藥劑（見表1）進行試驗，濃度為藥劑推薦濃度。設清水對照。每處理3棵藍莓樹，重復3次。藥劑噴施時以葉面噴施均勻、藥劑不下滴為準。

1.3 病害調查方法

噴藥2、4周后，每棵樹選擇東南西北4個方向各5個枝條，掛牌。統計枝條上的總葉片數、不同病級葉片數，計算病葉率、病情指數和相對防效。

病情分級標準：0級：無黑斑；1級：黑斑面積占葉片面積的25%及以下；2級：黑斑面積占葉片面積的26%～50%；3級：黑斑面積占葉片面積的51%～75%；4級：黑斑面積占葉片面積的76%及以上。

2 結果與分析

2.1 癥狀觀察

藍莓葉片正面、枝條上附著暗綠色霉層，初期點狀分布，后逐漸擴大至全葉及枝條，霉層厚而疏松（如圖1），影響植株的光合作用。該病春季主要發生于冬暖棚，棚內通風不良濕度增大，誘導該病發生，夏末雨季高溫潮濕易誘發大田煤污病。

2.2 病原菌鑒定

經形態學及分子生物學鑒定，引起藍莓煤污病的3種優勢病原菌為尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）[4]、枝細枝孢（Cladosporium ramotenellum）[4]、交鏈格孢（Alternaria alternate）[5]。

尖孢枝孢：在PDA培養基上28℃恒溫黑暗培養7 d后，菌落直徑達35 mm，菌落正面為深橄欖綠色，菌落邊緣近深灰色，背面深灰黑色，氣生菌絲短而致密；分生孢子橢圓形、檸檬形或近球形，無色或淡褐色，光滑，0～2個隔膜，分生孢子大小（2～5.6）μm ×（1.8～3.6）μm。經分子生物學鑒定，分離獲得菌株的ITS序列提交到GenBank比對，與登錄號為KT936546的菌株Cladosporium oxysporum同源性達100%。結合形態學和分子生物學鑒定結果確認該病菌為C.oxysporum。

枝細枝孢：在 PDA 培養基上28℃恒溫黑暗培養 7 d后，菌落直徑達65 mm，菌落平展，粉狀，近橄欖綠色，背面橄欖褐色，菌落有細微輪紋；分生孢子球形、近球形或卵形，單胞，（2.8～6.8）μm×（2.0～3.9） μm。經分子生物學鑒定，分離獲得菌株的ITS序列提交到GenBank比對，與登錄號為KP701972的菌株Cladosporium ramotenellum同源性達100%。結合形態學和分子生物學鑒定結果確認該病菌為C.ramotenellum。

交鏈格孢：在PDA培養基上28℃恒溫黑暗培養3 d后，菌落直徑達50 mm，菌落致密，深墨綠色，中夾雜灰色菌絲，背面呈黑褐色，有輕微同心輪紋，；分生孢子倒棒形，褐色，常有喙，有縱隔膜1～2個，橫隔2～5個，橫隔處有縊縮現象，大小為（11.5～30.5）μm × （6. 8～12.9）μm。經分子生物學鑒定，分離獲得菌株的ITS序列提交到GenBank比對，與登錄號為KU179665的菌株Alternaria alternate同源性達99%。結合形態學和分子生物學鑒定結果確認該病菌為A.alternate。

2.3 病原菌回接

將接種缽苗保濕培養3 d后，葉片上即可看見少許小點狀霉層長出，清水對照未發病，待典型病斑形成后，挑取少許霉層進行顯微鏡觀察，經驗證與田間發病所觀察情況一致，進一步證明3種優勢菌為藍莓煤污病病原菌。

2.4 藥劑篩選

如表2所示，試驗選擇的7種藥劑對藍莓煤污病的防治效果差異較大。其中10%多抗霉素防治效果最好，施藥4周后病情指數由施藥前的13.37下降到4.17，相對防效達78.56%，500 g/L異菌脲次之，施藥4周后病情指數由12.21下降到6.99，相對防效達64.09%，二者間差異不顯著。其余5種藥劑效果較差，相對防效均未超過50%，且五者間差異不顯著。

3 討論與結論

經過形態學及分子生物學鑒定，引起膠東半島藍莓煤污病的優勢病原菌為尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）、枝細枝孢（Cladosporium ramotenellum）、交鏈格孢（Alternaria alternate）。枝孢霉是引起多種植物煤污病的主要種群，如黃瓜煤污病[6]、柑橘煤污病[7]、小麥煤污病[8]等。C.ramotenellum是一種海洋真菌[9]，目前還沒有引發病害的報道。C.oxysporum可以引起辣椒葉斑病[10]，A.alternate可引起多種植物病害，如梨黑斑病[11]、棗斑病[12]、楊葉枯病[13]、番茄黑斑病[14]等。

由藥劑防治試驗可知，10%多抗霉素和500 g/L異菌脲對藍莓煤污病的防治效果優于其它5種藥劑，施藥4周后病情指數下降較快，相對防效分別為78.56%和64.09%，可在防治藍莓煤污病時應選擇10%多抗霉素與500 g/L異菌脲交替使用，以免病原菌產生抗藥性。

藍莓煤污病春季發生于冬暖大棚，此時如果棚內爆發蚜蟲，蚜蟲分泌的蜜露會誘發并加重煤污病的發生，所以春季防治蚜蟲也是預防煤污病發生的一個重要因素，同時棚內要開棚透風，避免濕度過大。藍莓煤污病也少量發生在果實上，在萼洼處出現厚霉層，藍莓煤污病對藍莓果實采后儲存是否有影響，還要進一步做儲藏試驗驗證。

參 考 文 獻：

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[4] 張中義.中國真菌志（第14卷）枝孢屬、黑星孢屬、梨孢屬[M].北京：科學出版社，2003.

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[11]王宏，常有宏，陳志誼.梨黑斑病病原菌生物學特性研究[J].果樹學報，2006，23（2）：247-251.

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