一個豬場高致病性PRRSV的分離鑒定

任素芳+郭立輝+李為棟+張召坤+李興光+崔寶玉+吳家強+張玉玉

摘 要：本研究對一個豬場高致病性PRRSV疑似病例進行了病理剖檢、PRRSV N蛋白基因RT-PCR擴增以及序列測定和分析。結果表明，N2號分離株N蛋白核苷酸序列與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為99.1%，N3/N4號與高致病性毒株的一致性均為98.9%，由此判定該豬場病豬感染毒株為高致病性PRRSV。該研究結果可為養豬生產中高致病性PRRSV感染的判斷提供借鑒。

關鍵詞：病理解剖；PRRS；高致病性PRRSV；RT-PCR；序列測定

中圖分類號：S858.285.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0129-04

Abstract The suspected cases of highly pathogenic PRRSV from a pig farm were conducted autopsy， the gene sequence of N-protein of PRRSV was amplified by RT-PCR， and then its sequence was determined and analyzed. The identity of the nucleotide sequence of N-protein was 99.1% between the isolate N2 and the highly pathogenic strains （JXA1， HuN4， SX-1 and TJM）， and that of isolate N3/N4 was 98.9% with the highly pathogenic strains. The results showed that the infected virus was highly pathogenic PRRSV in the pig farm. This research provided a reference for the diagnosis of highly pathogenic PRRSV infection in swine production.

Keywords Pathological anatomy； PRRS； Highly pathogenic PRRSV； RT-PCR； Sequencing

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）俗稱豬藍耳病，由動脈炎病毒科豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起，是一種急性病毒性傳染病[1，2]。高致病性PRRSV是我國現階段豬藍耳病流行的主導毒株，對豬呼吸系統、繁殖系統、神經系統、免疫系統、消化系統均有強的致病力，有很多豬場因為感染該病遭到毀滅性打擊[3-8]。2016年6月份，某自繁自養的豬場發生疫情，該豬場的哺乳仔豬陸續發病，出現眼瞼水腫、發熱、食欲減退、皮膚發紅、呼吸急促等現象，有的可見咳嗽、腹瀉、震顫等癥狀，發病率達到80%，死亡率達到50%以上，使用黃芪多糖、抗生素等治療效果均不明顯。

為了對該豬場病情進行確診，以便對癥治療，本研究對疑似病例進行病理解剖、RT-PCR擴增及序列測定和分析，以期對PRRSV毒株做出準確判斷， 為及時采取有效的控制措施、提高豬的成活率提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對4例病死豬進行解剖，觀察病理變化。分別采集各病豬的腎、脾、肺、淋巴結組織各少許，-20℃低溫保存備用。

1.2 材料和試劑

PRRSV陽性對照由本實驗室保存；RT-PCR一步法試劑盒、DL2000 DNA Marker、凝膠回收試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司。

1.3 引物設計與合成

根據PRRSV N蛋白基因序列設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列為正向引物F：5′-ATGCCAAATAACAACGG-3′；反向引物R：5′-TGCTGAGGGTGATGCTGT-3′。引物的擴增片段大小為369 bp。

1.4 樣品處理與RNA提取

樣品RNA的提取參照文獻[9]，試驗操作均在冰盒上完成，所用槍頭、離心管均為RNase-free。取約2 g病料加入適量滅菌的PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）進行研磨，研磨后反復凍融3次，4℃、5 000 r/min離心2 min；取250 μL上清加入750 μL Trizol和200 μL氯仿，振蕩混勻，-20℃靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取500 μL上清加入等量的異丙醇，顛倒數次，-20℃靜置20 min，4℃、12 000 r/min離心15 min收集沉淀；75%酒精洗滌沉淀后，20 μL滅菌水溶解沉淀即為樣品RNA，-80℃保存備用。

1.5 RT-PCR擴增

RT-PCR擴增采用一步法。反應體系為25 μL，其中：2× 1 Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL，RNA模板3 μL，RNase-free ddH2O 6.5 μL。反應程序為：50℃反轉錄30 min，95℃預變性1 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，重復30個循環； 72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 目的基因序列測定與分析

RT-PCR擴增產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。測序結果與GenBank發表的JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株、NADC30株、SD1株、VR2332株的N蛋白基因序列進行比對，使用DNASTAR軟件繪制進化樹。

2 結果與分析

2.1 病理變化

剖檢該豬場4例病死豬，發現有如下病理變化：淋巴結褐色腫大、有的出血，脾臟有梗死點，肺臟呈紅褐花斑狀且間質增寬，腎臟紫紅色且表面有零星的出血點，喉頭及氣管充血且含有少量液體泡沫。初步診斷該豬場感染了豬藍耳病病毒。

2.2 RT-PCR檢測結果

采集的4例病料提取RNA后，進行RT-PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，3例病料均有一條369 bp的特異DNA片段，與目的片段大小一致（圖1），說明所檢病料有3例為PRRSV陽性（表1），且2號和4號病料為強陽性。

2.3 序列測定及分析

2.3.1 序列同源性比對 RT-PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，序列命名為20160805_D17_N2_.seq、 20160805_D18-N3N4-.seq。將測定結果與GenBank發表的JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株、NADC30株、SD1株、VR2332株的N蛋白基因序列進行比對，如圖2所示。

同源性分析結果如圖3所示，N2號分離株N蛋白核苷酸序列與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為99.1%；與經典毒株（VR2332株、SD1株）的一致性均為 93.3%；與北美強毒株NADC30株的一致性為90.1%。N3/N4（N3、N4號混合）號與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為98.9%；與經典毒株（VR2332株、SD1株）的一致性均為93.3%；與北美強毒株NADC30株的一致性為90.2%。

2.3.2 進化樹分析 結果如圖4所示，20160805_D17-N2- .seq、 20160805_D18-N3N4- .seq與高致病性毒株N蛋白基因序列JXA1（EF112445）.seq等處于同一分支，與其余毒株的N蛋白基因序列關系較遠。說明所檢病料為高致病性PRRSV陽性。

3 討論與結論

傳統的病毒分離鑒定方法是無菌采取病豬的血清或腹水或取肺、扁桃體和脾等組織數小塊， 應用豬原代肺泡巨噬細胞培養物或MARC-145或HS2H細胞進行培養，然后再進行鑒定，這種方法費時費力，不適于疾病的快速診斷[10]。本研究通過病理剖檢、PRRSV N蛋白基因RT-PCR擴增以及序列測定和分析，證明某豬場PRRSV分離株與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）遺傳距離比較近，確定該豬場病死豬為高致病性PRRSV感染。

采用臨床剖檢和實驗室檢測相結合的手段快速鑒別診斷豬的藍耳病毒株，為指導養殖場采取相應的緊急防治措施提供了依據，從而減少豬場的經濟損失。

參 考 文 獻：

[1] Bilodeau R， Dea S， Sauvageau R A， et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome in Quebec[J]. Vet. Rec.， 1991， 129： 102-103.

[2] Halbur P， Paul P， Meng X， et al. Comparative pathogenicity of nine US porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） isolates in a five-week-old cesarean-derived， colostrum-deprived pig model[J]. J. Vet. Diagn. Invest.， 1996， 8： 11-20.

[3] Li Y， Wang X， Bo K， et al. Emergence of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in the Mid-Eastern region of China[J]. Vet. J.， 2007， 174（3）： 577-584.

[4] Tong G， Zhou Y， Hao X， et al. Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome， China[J]. Emerg. Infect. Dis.， 2007， 13（9）： 1434-1436.

[5] Zhou L， Zhang J， Zeng J， et al. The 30-amino-acid deletion in the Nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence[J]. J. Virol.， 2009， 83 （10）： 5156-5167.

[6] Wu J， Li J， Tian F， et al. Genetic variation and pathogenicity of highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China[J]. Arch. Virol.， 2009， 154（10）： 1589-1597.

[7] 安同慶，田志軍，李冉，等. 我國高致病性豬藍耳病病毒的演化分析[J]. 中國獸醫雜志，2011，47（4）：3-6.

[8] 賈銳，葉佳欣，俞向前，等. 華東地區部分豬場豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測及其ORF5遺傳變異分析[J]. 畜牧與獸醫，2014，46（11）：68-73.

[9] 張金強，吳家強，孟斌，等. 多重RT-PCR檢測PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遺傳變異分析[J]. 中國獸醫學報，2011，31（5）：633-637.

[10]吳高鋒，李文剛，高衛科，等. 豬繁殖與呼吸綜合征診斷及防制研究進展[C]//中國畜牧獸醫學會動物傳染病學分會豬病防控學術研討會.2008：20-22.