東亞鉗蝎毒素對人結腸癌細胞Caco—2的增殖抑制作用研究

賀源+肖凱夫+王智

摘 要：為研究東亞鉗蝎毒素對人結腸癌細胞Caco-2增殖的影響，以不同濃度的東亞鉗蝎毒素（10、20、40 μg/mL）干預體外培養(yǎng)的Caco-2細胞，分別于24、48 h后，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法，觀察毒素對Caco-2細胞的增殖抑制作用，運用淋巴細胞轉化試驗和乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗檢測蝎毒素對Caco-2細胞的作用途徑。結果表明：東亞鉗蝎毒素不僅能抑制Caco-2細胞的增殖而且能促進淋巴細胞轉化，且毒素對Caco-2細胞增殖的抑制作用具有濃度和時間的依賴關系，隨濃度加大和時間延長，對Caco-2細胞增殖的抑制作用增強。

關鍵詞：Caco-2人結腸癌細胞；東亞鉗蝎毒；細胞增殖；抗腫瘤

中圖分類號：Q78文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0136-06

Abstract The effects of Buthus martensii Karsch venom on proliferation of human colon adenocarcinoma cell line Caco-2 were investigated in this study. The test used different concentrations （10， 20， 40 μg/mL） of Buthus martensii Karsch venom to interfere the Caco-2 cells cultured in vitro for 24 and 48 hours， then the proliferation inhibition effects was observed by means of MTT assay. The mechanism of venom on Caco-2 cells was measured by lymphocyte transformation and lactate dehydrogenase release assays. The data indicated that Buthus martensii Karsch venom could inhibit the Caco-2 cell proliferation and promote the lymphocyte transformation. Besides， the inhibition effects were closely related to the treatment time and venom concentration， which enhanced with the extension of treatment time and increase of venom concentration.

Keywords Human colon adenocarcinoma cell line Caco-2； Buthus martensii Karsch； Cell proliferation； Antitumor

癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的第一殺手[1]，也是死亡率最高的疾病之一[2，3]，癌癥的預防與治療任務十分艱巨[4]。根據(jù)目前癌癥的發(fā)病趨勢，2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%[5]。因此，找到并運用新的抗癌藥物成為人類戰(zhàn)勝癌癥的關鍵。

現(xiàn)有研究表明，蝎毒對腫瘤細胞有直接殺傷作用，能有效地導致癌細胞凋亡[6]。蝎毒在抗腫瘤的同時還具有明顯的調節(jié)和增強機體免疫力的作用，是一種理想的抗腫瘤藥物[7-10]。目前，關于蝎毒抗腫瘤研究的報道很多，對蝎毒素的分離、純化及藥理作用等也進行了深入研究[11-16]。本研究就是在前人工作的基礎上，以常見的東亞鉗蝎（Buthus martensii Karsch）毒素作為研究材料，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法，觀察不同濃度東亞鉗蝎毒素處理不同時間對Caco-2細胞的增殖抑制作用，同時通過淋巴細胞轉化試驗考察蝎毒是否具有免疫調節(jié)作用，通過LDH釋放試驗檢測細胞受損程度，從而探討該毒蝎毒素對Caco-2結腸癌細胞增殖的抑制作用途徑，以豐富蝎目動物在毒理學和藥理學等方面的理論內涵，為東亞鉗蝎毒素的開發(fā)與利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品與試劑 東亞鉗蝎毒素，由湖南農(nóng)業(yè)大學動物研究室提取，-20℃長期保存，完全培養(yǎng)液溶解，細菌過濾器過濾滅菌，按試驗要求加入完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

青霉素和鏈霉素，華北制藥股份有限公司產(chǎn)品；DMEM（高糖）培養(yǎng)基，Hyclone產(chǎn)品；0.1%胰蛋白酶（含EDTA）、谷氨酰胺（1 mL/支）和0.01 mol/L等滲PBS液（pH 7.4），均為湘雅第二附屬醫(yī)院實驗中心分裝配置；胎牛血清（FCS），杭州四季青生物工程材料公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（dimethylsulfoxid，DMSO），合肥博美生物科技有限責任公司；四甲基氮唑鹽（3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT），Sigma公司國產(chǎn)分裝；刀豆素Con-A（Cat.No.C8110），為Sigma公司產(chǎn)品；細胞裂解液（Cat#RT1220），北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 分析天平，上海天平儀器廠；細菌過濾器，日本NIPPON公司；25 cm2培養(yǎng)瓶（Cat-NO.：690 170），德國Greiner Bio-One GmbH產(chǎn)品；96孔培養(yǎng)板，美國COSTAR公司；移液槍（20、200、1 000 μL），湖南農(nóng)業(yè)大學生化實驗室提供；Tips，Hlue Light Biiolab 技術公司；冰箱（BCD-213型），海爾集團；低溫冰箱（MDF-328E型），日本SANYO公司；細胞計數(shù)板，上海天光玻璃儀器廠；CO2培養(yǎng)箱，Thermo Forma；倒置相差顯微鏡（LH-50A型），日本OLYMPUS公司；超凈工作臺，Thermo Electron Corporation；低速離心機，北京醫(yī)用離心機廠；全自動酶標儀，Thermo Labsystems。

1.1.3 動物與細胞株 昆明種小鼠，購自湖南思萊克景達實驗動物有限公司。Caco-2人結腸癌細胞，由中南大學湘雅醫(yī)學院藥學院熊友健惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 Caco-2細胞的復蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存 細胞復蘇、培養(yǎng)：將冷凍管迅速由-80℃低溫冰柜轉入37℃恒溫水浴箱中，搖動使其快速溶解， 將解凍后細胞轉移到含4℃預平衡培養(yǎng)液的試管中；75%乙醇消毒凍存管，立即移入超凈工作臺中，在無菌條件下打開凍存管，用吸管吸取細胞懸液于無菌離心管中；蓋好蓋子，輕輕搖勻，細胞懸液在4℃下500×g離心10 min；棄上清，向沉淀中加入5 mL含150 U/mL青霉素、鏈霉素和10% FCS的DMEM培養(yǎng)液，將細胞轉移到25 cm3無菌細胞培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞傳代：每2～3 d，待細胞進入對數(shù)生長期后，將生長狀態(tài)良好的Caco-2細胞從CO2培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗2遍；加入少許0.1%胰蛋白酶消化液（含EDTA）進行預消化，后加入1 mL胰酶，于37℃靜置2～3 min。在倒置顯微鏡下觀察被消化細胞，如果細胞邊緣變圓，相互之間不再連接成片，立即在超凈臺中將胰蛋白酶消化液倒掉，加入2 mL含血清新鮮培養(yǎng)液終止消化，用吹打管吹打200～300次，制成細胞懸液。將細胞懸液各吸出1 mL分別加到另4個培養(yǎng)瓶中，并向每個瓶中分別加3～4 mL培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞凍存：在收集細胞24 h前更換培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細胞，按比例（培養(yǎng)液∶血清∶DMSO=7∶2∶1）配置凍存液；倒掉瓶內培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗2遍；加入少許0.1%胰蛋白酶消化液（含EDTA）消化2～3 min，滴加DMEM培養(yǎng)液，制成1 mL細胞懸液，4℃條件下900×g離心5 min；將沉淀的細胞重新懸浮在凍存液中（約1×107個細胞/mL凍存液），制成細胞懸液；每個冷凍管中加入1.5 mL細胞懸液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽（MTT）藥敏試驗 取對數(shù)生長期的Caco-2細胞，用0.1%胰酶（含EDTA）消化，并用細胞計數(shù)板計數(shù)，用高糖DMEM培養(yǎng)基調整細胞密度，終密度約為3×104個/mL。將懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，并分別加入陰性對照PBS緩沖液、陽性對照Con-A及不同濃度的東亞鉗蝎毒素（10、20、40 μg/mL）各200 μL，每處理重復3個孔。另設只加DMEM培養(yǎng)液不加細胞的空白對照。置于飽和濕度、溫度37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h，各培養(yǎng)孔加入1 mg/mL MTT 10 μL，4 h后棄去培養(yǎng)上清，PBS緩沖液充分洗滌細胞，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器上振蕩10 min，充分溶解甲臜（formazan）結晶，酶標儀檢測各孔吸光度A值，測定波長λ=570 nm，參考波長λ=630 nm。計算相對于陰性對照的生長抑制率。

抑制率（CI，%）=（陰性對照組A值-試驗組A值）/陰性對照組A值×100

1.2.3 淋巴細胞轉化試驗 小鼠脾細胞的制備：將小鼠折頸處死后，立即用75%乙醇溶液浸泡消毒體表；無菌條件下取脾臟，置于D-hanks緩沖液中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單細胞懸液；400目篩網(wǎng)過濾，用PBS緩沖液洗3次，每次離心10 min（800×g），棄上清液；加入5～7 mL紅細胞裂解液使紅細胞溶解，37℃水浴5～10 min，800×g離心10 min，棄上清；加入適量PBS緩沖液吹吸混勻，800×g離心10 min，棄上清；將細胞懸浮于2 mL完全培養(yǎng)液中，血球計數(shù)板計數(shù)，高糖DMEM完全培養(yǎng)液將細胞數(shù)調成5×105個/mL。

試驗分組：陽性對照組（在小鼠脾細胞懸液中加入濃度為10 μg/mL的Con A溶液）；陰性對照組（在小鼠脾細胞懸液中加入濃度為10 μg/mL的PBS緩沖液）；試驗組（在小鼠脾細胞懸液中分別加入濃度為10、20、40 μg/mL東亞鉗蝎毒素）。

試驗程序：調整細胞濃度為5×105個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，24 h后棄舊培基，分別加入各組溶液，重復6孔。將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μL 1 mg/mL MTT，4 h后棄去上清，PBS緩沖液充分洗滌細胞，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器上振蕩10 min，充分溶解甲臜結晶。酶標儀檢測各孔吸光度A值，測定波長λ=570 nm，參考波長λ=630 nm。計算轉化指數(shù)。

轉化指數(shù)（%）=（加Con A孔A值-不加Con A孔A值）/加Con A孔A值×100

1.2.4 乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗 將Caco-2細胞以3×104個/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2孵育24 h，無血清同步化處理后隨機分組，對照組和試驗組細胞處理及細胞分組同上，每份樣品重復3孔。常規(guī)條件下孵育后于24、48 h后收集上清液，用紫外分光光度計比色法檢測LDH釋放量，計算LDH釋放率。

LDH釋放率（%）=（LDH上清液釋放量-LDH原標本量釋放量）/LDH原標本釋放量×100

2 結果與分析

2.1 Caco-2細胞的體外培養(yǎng)

日常細胞培養(yǎng)過程發(fā)現(xiàn)，Caco-2細胞進行傳代的標準為細胞長至對數(shù)生長期時即長滿培養(yǎng)瓶底70%～80%；倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)24 h的細胞為鋪路石狀（圖1）：細胞貼壁良好，形態(tài)完整，細胞連接緊密，數(shù)量多。由于該細胞貼壁較強、胞間連接較緊密，所以在胰酶作用消化時間和細胞吹打上，可以考慮稍加延長，即消化3 min，吹打300次為宜。

2.2 東亞鉗蝎毒素對Caco-2人結腸癌細胞增殖抑制作用的量效關系

MTT藥敏試驗結果表明，與陰性對照比較，處理Caco-2細胞24 h后，蝎毒處理組貼壁細胞數(shù)量稀少，且隨蝎毒處理濃度增加越來越少，細胞形態(tài)也變得欠清晰（圖2）；不同濃度東亞鉗蝎毒素對Caco-2細胞均有抑制作用，且抑制率隨毒素濃度升高而遞增，具有良好的量效關系（圖3）。

2.3 東亞鉗蝎毒素對Caco-2人結腸癌細胞增殖抑制作用的時效關系

MTT試驗結果表明，各濃度毒素對Caco-2細胞的增殖抑制率均為48 h時高于24 h時，即隨時間延長而增加，可見各濃度毒素對Caco-2細胞的生長具有時間依賴性（圖4）。

2.4 Caco-2人結腸癌細胞經(jīng)毒素作用后淋巴細胞轉化結果

由表1可知，與陰性對照相比， 20、40 μg/mL東亞鉗蝎毒素可以顯著促進淋巴細胞轉化（P<0.05）。

2.5 乳酸脫氫酶（LDH）釋放率檢測

由圖5可見， 隨著東亞鉗蝎毒素濃度的增加和時間的延長，Caco-2細胞中LDH的釋放率逐漸增加。

3 討論

3.1 MTT藥敏試驗檢測細胞活性

本研究使用Caco-2人結腸癌細胞進行體外試驗，這是篩選和研究抗腫瘤藥物常用的重要手段，通常采用定量反應亞致死損傷性四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞活性。MTT分析法以代謝還原MTT為基礎。MTT是一種能接受含氫原子的染料，可被水溶解和透過細胞膜進入細胞內。有核活性細胞，特別是增殖期細胞，其線粒體內存在NADP相關的脫氫酶（琥珀酸脫氫酶），通過線粒體的能量代謝能將黃色的MTT還原成不溶的藍紫色甲臜，沉積在細胞周圍。在一定細胞數(shù)范圍內甲臜結晶物形成量與活細胞數(shù)目和功能狀態(tài)呈正相關。用DMSO將甲臜溶解后，可用酶標儀在570 nm處測定其吸光度（A值），即可測出存活細胞數(shù)，并計算出細胞抑制率[17]。

MTT法可進行高通量檢測，并且定量檢測靈活簡便，與其他檢測細胞活力的方法有良好的相關性，也常用于新研制抗癌藥物的體外抗癌活動及抗癌譜篩選。但它容易受到藥物的影響，由于藥物和MTT溶液會生成有色復合物——甲臜，甲臜有時易聚成團干擾對結果的測試，使測定的A值不能反映實際的活細胞數(shù)。

本研究結果表明，與對照組相比，東亞鉗蝎毒素隨著濃度加大和作用時間延長，對Caco-2細胞增殖的抑制作用增強，即該抑制作用具有濃度和時間的依賴關系。

3.2 淋巴細胞轉化試驗方法的選擇

淋巴細胞轉化試驗是細胞免疫試驗的一種，又稱T細胞轉化試驗。T細胞在體外經(jīng)某種物質刺激，細胞代謝和形態(tài)相繼發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為短時間內細胞表面電荷即起變化，數(shù)小時后細胞內酶活化，在24～48 h細胞內蛋白質和核酸合成增加，從而產(chǎn)生一系列增殖變化，如細胞變大、細胞漿擴大、出現(xiàn)空泡、核仁明顯、染色質疏松、淋巴細胞轉變成母細胞等[18]。因此，這種淋巴細胞增殖又稱淋巴母細胞轉化。細胞轉化情況可反應機體的細胞免疫水平，淋巴細胞轉化率低則表示細胞免疫水平低。當T淋巴細胞受Con A、PHA等致分裂原或特異性抗原刺激后發(fā)生母細胞轉化，活細胞特別是增殖細胞通過線粒體水解將MTT分解為藍紫色的甲臜結晶而顯色，其光密度值能夠反映細胞的增殖情況[19]。

本試驗結果顯示，東亞鉗蝎蝎毒能促進淋巴細胞轉化。可見促進淋巴細胞轉化是該蝎毒的抗腫瘤機制之一，同時也是研發(fā)一種既能殺傷腫瘤細胞又能促進淋巴細胞轉化的新藥物的根據(jù)之一。

3.3 LDH釋放試驗檢測細胞生化指標的改變

LDH是廣泛存在于細胞漿內的一種生物酶，它在細胞漿內的濃度是細胞外濃度的約500倍，在正常生理條件下，它不能透過細胞膜釋放，當細胞膜受到損傷，即細胞受到毒性作用時，它可以進入細胞外液，升高細胞外LDH濃度。該分析在實驗前不需要標記細胞，不需要處理放射性廢棄物，可揭示早期、低水平的不能被其它方法檢測到的細胞膜損壞，所以測定細胞培養(yǎng)液LDH的釋放率是一個穩(wěn)定而實用的指標。因此，該法常用于監(jiān)測藥物對細胞的毒性作用[20]與衡量細胞的受損程度，也是進行藥物篩選的一個有效方法。

LDH是一種極為穩(wěn)定的細胞質酶，在外界刺激下，如果細胞膜破裂，LDH就會被釋放。乳酸與氧化型輔酶Ⅰ（NAD）在LDH催化作用下生成丙酮酸和還原型輔酶Ⅰ（NADH），丙酮酸再和2，4-二硝基苯肼反應生成2，4-二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈棕紅色，釋放出的乳酸脫氫酶存在于培養(yǎng)物上清中，LDH釋放量與裂解細胞的數(shù)目呈正比，用全自動生化檢測儀30 min內測量丙酮酸含量推算出LDH活力。

4 結論

經(jīng)MTT法、淋巴細胞轉化試驗、LDH釋放試驗可知，10、20、40 μg/mL東亞鉗蝎毒素對Caco-2細胞增殖都有抑制作用以及良好的量效關系和時效關系。東亞鉗蝎毒素（20、40 μg/mL）對淋巴細胞的增殖反應有一定刺激作用，可見該蝎毒的抗腫瘤機制之一是促進淋巴細胞轉化。此外，東亞鉗蝎毒素（10、20、40 μg/mL）對Caco-2細胞的毒性作用使細胞膜受損、LDH釋放率增加，結果呈濃度和時間依賴關系。

總之，研究一種藥物的抗腫瘤機制，不僅要以該藥對腫瘤細胞增殖的抑制作用為依據(jù)，還需從促進癌細胞凋亡和引起細胞周期阻滯等多個途徑進行探究，從而為蝎毒素作為多肽類生化抗腫瘤藥物提供多方面的理論參考。

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