布魯氏菌BP26蛋白的原核表達及鑒定

魯友銘,李俊萱，吳勝昔，曾 政，黃 恒，李令臣，侯力嘉

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054；2.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心， 重慶 401120)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜共患病，也是世界上流行性最廣、危害最大的一種人畜共患病。布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，因其可以感染人類與其他60余種哺乳動物，導(dǎo)致宿主出現(xiàn)流產(chǎn)、發(fā)熱、關(guān)節(jié)性損傷等患病特征，對發(fā)展中國家畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。近期我國頒布多項政策與法律以達到對布魯氏菌病的及時防控[1-2]。早期、快速、準確地診斷該病是防控與凈化該病的關(guān)鍵。現(xiàn)有的布魯氏菌病的實驗室診斷技術(shù)標準主要包括虎紅平板凝集試驗(RBT)、全乳環(huán)狀試驗(MRT，僅限于乳牛)、試管凝集試驗(SAT)、補體結(jié)合試驗(CFT)、抗人球蛋白試驗(AGT,僅限于人)、間接酶聯(lián)免疫吸附測定(IELISA)、競爭酶聯(lián)免疫吸附測定(CELISA)、補體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附測定(CF-ELISA)、膠體金技術(shù)(GICT)、熒光偏振試驗(FPA)以及各類核酸診斷技術(shù)等[3]。其中RBT、MRT僅限于布魯氏菌的初步篩選。而以SAT為典型的傳統(tǒng)血清學(xué)試驗存在假陽性與假陰性的現(xiàn)象，無法區(qū)分人工免疫以及自然感染。ELISA為主的新型免疫學(xué)與分子生物學(xué)診斷技術(shù)各具特色，但都存在一定的局限性[4]。外膜蛋白是布魯氏菌的主要毒力因子，其通過干擾巨噬細胞抗原呈遞活性，促使布魯氏菌逃離宿主的免疫反應(yīng)，從而在宿主中大量增殖[5]。BP26(Omp26)蛋白是布魯氏菌的優(yōu)勢蛋白，是一種具有強免疫原性的外膜蛋白，也是目前普遍采用的基因敲除候選蛋白。在感染的動物血清當中均可找到BP26蛋白的單克隆抗體的存在[6-7]。BP26蛋白可以引起宿主細胞的炎性反應(yīng)，具有一定的細胞毒性作用[8]。

本次課題通過原核表達的方式，純化出了純度及濃度較高的BP26蛋白，為后續(xù)布魯氏菌病的檢測提供了有效試劑及為布病疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)由上海唯地生物科技有限公司提供；質(zhì)粒載體pET28a(+)由重慶理工大學(xué)生生物制藥實驗室保存并提供；布魯氏菌BP26質(zhì)粒、 DH5α甘油菌由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并提供。

1.2 主要試劑及儀器

卡那霉素(Kanamycin)、IPTG，PMSF購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；5×Loading buffer購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP-羊抗小鼠IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Monoclonal anti-HIS Tag antibody購自美國SIGMA公司；NdeI、Xhol I、10×Q.Cut.G.Buffer購自TAKARA生物技術(shù)(北京)有限公司；MULTISKAN GO購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；NGCTMChromatography System、Bio-ScaleTM親和層析Ni柱均購自美國Bio-Rad公司;Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀購自美國GE公司。

1.3 序列分析、合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的布魯氏菌BP26基因序列 (GenBank登錄號： U45996)，對序列分析后進行大腸桿菌宿主密碼子優(yōu)化，使其適用于大腸桿菌表達系統(tǒng)，質(zhì)粒載體選擇pET30a(+)。交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并構(gòu)建。

1.4 pET30a(+)-BP26重組載體的酶切鑒定

將轉(zhuǎn)化后的pET30a(+)-BP26/BL21(DE3)進行甘油保菌。

1.5 重組載體的轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pET30a(+)-BP26通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，具體操作步驟參考文獻[9]。

余蔭山房中植物景觀元素類型豐富，既有本地品種，也有外來品種，其中喬木24種，灌木24種，集中分布于前庭院和周圍，與園中建筑相得益彰。“深柳堂”前炮仗花為園主親手種植，干粗如樹，形如盤龍繞住，在春節(jié)前后花朵盛開時狀如串串炮竹，呈現(xiàn)“紅雨”視覺景觀[10]。旱庭中的南洋杉為西方的樹種，引自大洋洲，與余蔭山房中的幾何水池、拱形門窗、彩色玻璃相互映襯。“來熏亭”一側(cè)的木菠蘿冠幅寬大，葉色濃綠亮澤，宛如綠云遮蓋，極富嶺南風情[11]。“玲瓏水榭”東側(cè)對植桂花，除了追求秋季盛開時花香滿園的嗅覺感受外，更加象征了園主家族“一門三舉人，父子同折桂”的崇高榮譽。

用接種環(huán)蘸取少量DH5α甘油菌，在含有卡那霉素抗性LB平板上劃線接菌，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進行過夜培養(yǎng)。挑取單菌落提取質(zhì)粒。將提取出的質(zhì)粒利用Nde I、Xhol I限制性核酸內(nèi)切酶進行雙酶切，37 ℃水浴條件下酶切1 h。之后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.6 pET30a(+)-BP26重組蛋白的表達與鑒定

取出保藏好的甘油菌進行平板劃線，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)小時。當菌液OD600 nm值達到0.8時，加入適量的IPTG，于37℃誘導(dǎo)數(shù)小時。取誘導(dǎo)后的菌液沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定。

趙雪梅 女，1989年9月出生于遼寧省阜新市，2012 年于遼寧工程技術(shù)大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，2017年于遼寧工程技術(shù)大學(xué)獲得博士學(xué)位，現(xiàn)于中國科學(xué)院遙感與數(shù)字地球研究所做博士后研究工作，主要研究方向為遙感圖像分割及基于深度學(xué)習(xí)的Landsat圖像分類.

1.7 pET30a(+)-BP26重組蛋白的誘導(dǎo)表達條件篩選

1) 設(shè)置IPTG的濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)時間為6 h。設(shè)置16、25、37 ℃這3組溫度變量。所得菌液經(jīng)過SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示，表明重組蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度為37 ℃。

1.8 pET30a(+)-BP26蛋白的大量表達及純化

按照本文1.7節(jié)確定的最佳誘導(dǎo)條件，利用200 mL LB液體培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化菌進行搖床培養(yǎng)與誘導(dǎo)。對于誘導(dǎo)后的菌液按照包含體純化的方法進行處理。利用Bio-Rad公司的NGCTMChromatography System對處理后的樣品進行親和層析。詳細操作步驟見文獻[10]。

1.9 重組蛋白pET30a(+)-BP26 的Western Blot鑒定

設(shè)置了誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度及時間3個影響因素對重組蛋白pET30a(+)-BP26進行最佳誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。探索出其最佳誘導(dǎo)條件為：37 ℃，1mmol/L IPTG,誘導(dǎo)8 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶切結(jié)果

酶切結(jié)果見圖1。

傅向升指出，華誼集團傳承歷史、弘揚傳統(tǒng)，激勵斗志、振奮精神，不忘初心、勇?lián)熑危谛滦蝿菹氯A誼集團要提高思想站位、擴大開放合作、加快自主創(chuàng)新、推動轉(zhuǎn)型發(fā)展。

M:DNA分子質(zhì)量標準；1：pET30a(+)-BP26經(jīng)Nde I、Xhol I雙酶切上樣

2.2 重組蛋白pET30a(+)-BP26的誘導(dǎo)表達鑒定

2) 在37 ℃條件下，設(shè)置了不同的IPTG濃度進行相同時間誘導(dǎo)，所得菌液經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明：重組蛋白在37 ℃，IPTG誘導(dǎo)濃度為1 mmol/L時，蛋白表達量最高。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準; 1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)上清; 2.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)沉淀; 3.加入IPTG誘導(dǎo)上清; 4.加入IPTG誘導(dǎo)沉淀; 5.空載體pET30a(+)誘導(dǎo)上清; 6.空載體pET30a(+)誘導(dǎo)沉淀

圖2 重組蛋白pET30a(+)-BP26的鑒定

2.3重組蛋白pET30a(+)-BP26誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

將純化后的目的蛋白pET30a(+)-BP26進行SDS-PAGE電泳，然后將目的條帶利用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%的脫脂奶粉進行封閉。以Monoclonal anti-HIS Tag antibody為一抗(1∶4 000)，4 ℃孵育過夜，第2天于水平搖床孵育2 h。將PVDF膜放入TBST中清洗3次，每次10 min。以羊抗鼠IgG-HRP為二抗(1∶4 000)37 ℃水平搖床孵育1 h，再將PVDF膜放入 TBST洗3次，每次10 min，加入顯色液(A液+B液)孵育5 min，最后用Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀進行化學(xué)發(fā)光成影。

藥品流通集團型企業(yè)一般經(jīng)濟實力雄厚，商業(yè)誠信度較高，通常在多地設(shè)有全資（控股）子公司，各個子公司在其所在地有較好的業(yè)務(wù)優(yōu)勢。藥品生產(chǎn)企業(yè)從減少自身風險的角度出發(fā)，通常愿意與此類企業(yè)合作，使得此類企業(yè)更容易獲得藥品配送權(quán)。由于集團內(nèi)部向全資（控股）子公司或全資（控股）子公司之間調(diào)撥藥品可不視為“一票”，藥品在集團型企業(yè)中的流轉(zhuǎn)更為便利，貨源更為充足，有利于下游業(yè)務(wù)的拓展，從而形成良性循環(huán)。在“兩票制”的大環(huán)境下，此類企業(yè)更容易進一步做大做強。

將pET30a(+)-BP26質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落接種于5 mL卡那霉素抗性試管中，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)至菌液OD600 nm值達到0.8。將各試管按IPTG濃度梯度(0.1、0.5、1 mmol·L-1)、溫度梯度(16、25、37 ℃)以及時間梯度(4、6、8 h)進行誘導(dǎo)篩選。將樣品進行SDS-PAGE電泳分析確定最佳誘導(dǎo)條件。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.未誘導(dǎo)對照；2. 16 ℃誘導(dǎo)表達沉淀；3. 16 ℃誘導(dǎo)表達上清；4. 25 ℃誘導(dǎo)表達沉淀；5. 25 ℃誘導(dǎo)表達上清；6. 37 ℃誘導(dǎo)表達沉淀；7. 37 ℃誘導(dǎo)表達上清; 8.空載體沉淀; 9.空載體上清

圖3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

將經(jīng)pET30a(+)-BP26和pET30a(+)轉(zhuǎn)化的重組菌株在相同誘導(dǎo)溫度、相同IPTG劑量、相同誘導(dǎo)時間進行誘導(dǎo)表達，超聲破菌，分別取沉淀和上清與適量的1× PBS溶解，煮樣10 min，然后進行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果表明：重組菌株在未加入IPTG誘導(dǎo)時，目的蛋白具有少量的表達，在經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，表達量會有一定的增加，而空載體對照沒有相應(yīng)條帶出現(xiàn)(27.8 kDa處),見圖2。這與預(yù)期分子量大小相一致，說明重組蛋白pET30a(+)-BP26成功進行了表達。

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.未誘導(dǎo)沉淀；2.0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)沉淀；3.0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清4.0.5mol/L IPTG誘導(dǎo)沉淀；5.0.5mol/LIPTG誘導(dǎo)上清；6.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)沉淀；7.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清

圖4 IPTG濃度的優(yōu)化

3) 在37 ℃條件下，IPTG誘導(dǎo)濃度為1 mmol/L，設(shè)置了不同的誘導(dǎo)時間，所得菌液經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明：BP26重組蛋白在37 ℃，IPTG誘導(dǎo)濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)8 h蛋白表達量最高。

沒有找到工作的同學(xué)都來向李麗請教，李麗說是自己運氣好，可這樣的借口哪能打發(fā)得了同學(xué)們，最后李麗被纏得實在沒有辦法了，只好說出了自己的秘密：

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.未經(jīng)誘導(dǎo)菌液沉淀；2.誘導(dǎo)4 h菌液沉淀；3.誘導(dǎo)4 h菌液上清；4.誘導(dǎo)6 h菌液沉淀；5.誘導(dǎo)6 h菌液上清；6.誘導(dǎo)8 h菌液沉淀；7.誘導(dǎo)8 h菌液上清

圖5 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化

2.4 目的蛋白pET30a(+)-BP26的純化以及SDS-PAGE鑒定

采用Ni柱親和層析的方法對經(jīng)過尿素變性后的目的蛋白進行純化，用不同濃度的咪唑(50、100、200、400、500 mM)對目的蛋白進行梯度洗脫，收集280 nm紫外吸收峰的洗脫液。結(jié)果顯示：200 mmol/L咪唑可以將目的蛋白全部洗脫下來。

1批性狀不符合規(guī)定，其余白礬樣品均符合規(guī)定。不符合規(guī)定樣品的性狀為無味，與標準規(guī)定的“氣微、味酸、微甘而極澀”不符。對不符合規(guī)定樣品進行含量測定項檢驗，含量測定結(jié)果表明該樣品含水硫酸鋁鉀含量極低，為0.4%，標準規(guī)定含水硫酸鋁鉀不得少于99.0%，涉嫌造假。為此，在探索性研究工作中對其成分進行了分析和鑒定。

將純化后的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖6所示。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.BP26純化蛋白；2.BP26- pET30a(+)/BL21(DE3)原菌液3.pET30a(+)/BL21(DE3)原菌液

圖6 純化后的目的蛋白pET30a(+)-BP26 SDS-PAGE鑒定

2.5 目的蛋白pET30a-BP26的Western Blot鑒定

Western Blot顯示在27.8 kD處有明顯的蛋白印跡出現(xiàn)(見圖7)，與預(yù)期的結(jié)果一致，說明已經(jīng)成功表達出目的蛋白。

1.重組蛋白pET30a(+)-BP26；2.pET30a(+)空載體對照

3 討論

布魯氏菌是一種動物病原體，可引起人布魯氏菌病。雖然布魯氏菌作為一種偶發(fā)宿主感染人類，但每年仍有50萬例新的人類感染案例，而且尚未有對病人有效的治療方案或批準的人類疫苗的報告。布魯氏菌對淋巴細胞和生殖系統(tǒng)具有很強的組織趨向性，其在人體細胞內(nèi)的生活方式限制了先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)對其抗原表位的暴露，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)無法識別病原菌，所以人患布魯氏菌病在很多情況下是一種終生疾病[11]。BP26蛋白是布魯氏菌病的一種很好的診斷抗原，可用于驗證性試驗，并可用于天然感染和人工疫苗接種的血清學(xué)鑒別，所以BP26蛋白的制備對于布魯氏菌病的診斷以及治療具有關(guān)鍵作用[12]。到目前為止，前人研究共發(fā)現(xiàn)7種布魯氏菌外膜蛋白，而25～27 k、31～34 k、36～38 k這3種是菌體表面最主要的外膜蛋白，而BP26蛋白則屬于25～27 k這一種屬[13]。Cloeckaert等使用cELISA對布魯氏菌外膜蛋白與陽性血清特異性反應(yīng)進行了分析，總結(jié)得出外膜蛋白10 k、16.5 k、19 k、25～27 k、36～38 k都可以檢測出陽性血清，所以BP26蛋白作為布病的檢測抗原具有可行性基礎(chǔ)[14]。有學(xué)者將BP26蛋白與Omp10蛋白聯(lián)合運用在布病的血清學(xué)檢測當中，對檢測的靈敏性與特異性都有了一定的提高，并且可以區(qū)分自然感染與人工免疫，對布病檢測技術(shù)的研究具有重要的意義[15]。本實驗利用原核表達系統(tǒng)大量制備目的蛋白BP26，避免了化學(xué)合成目的蛋白的高成本以及真核表達系統(tǒng)的長周期、表達量少、造價高等缺點[16]。純化后的目的蛋白是與His6多肽、S·Tag、Thrombin site、Enterokinas site結(jié)合形成的融合蛋白，且重組蛋白是以包涵體的形式存在于宿主細胞中，這一點符合重組基因在原核表達系統(tǒng)的一般規(guī)律[17]。本次實驗成功制備出了目的蛋白BP26包涵體，對接下來的BP26單克隆抗體的制備以及布魯氏菌病的快速檢測具有重要的意義。