菌種保藏方法及復壯技術

●食用菌栽培●

菌種保藏方法及復壯技術

10.16627 /j.cnki.cn22-1215/s.2017.06.022

菌種保藏的原理是通過干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養等方法，使菌種的代謝水平降低，乃至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態，而在一定時間內得到保存。需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復活力，使菌種在較長期的保藏之后仍然保持著原有的生命力、典型的形態特征、優良生產性能。目前常用的菌種保藏方法有以下幾種。

1 菌種保藏方法

1.1 斜面低溫保藏法

將需要保藏的菌種，接種在適宜的斜面培養基上，菌絲長滿斜面時，用硫酸紙包扎棉塞，旋轉在4℃的冰箱保藏。由于微生物的新陳代謝活動未停止，試管內培養基易失水變干，因此，保藏時間較短，轉管次數多，不適于長期保藏。每隔六個月轉管一次。草菇菌種不耐低溫，需保藏在10～12℃，或在草菇菌落上灌注3～4毫升的防凍劑（10%的甘油）。如菌絲長滿斜面后，在無菌條件下，用無菌橡皮塞代替棉塞，并用石蠟密封，即可在室溫或冰箱中保藏。這種方法可防止雜菌污染，隔絕氧氣，避免培養基干燥，使用方便。

1.2 液體石蠟保藏法

石蠟防止培養基水分蒸發，隔絕斜面菌絲與空氣接觸，降低微生物代謝活性，使其處于休眠狀態，因此能延長微生物的生命，保持菌種優良的種性。一般可保藏3～5年，是一種中長期的菌種保藏方法。

液體石蠟選用化學純的，在121℃下高溫滅菌30分鐘，再將液體石蠟在160℃烘箱中保溫1～2小時，蒸發掉液體石蠟中的水，或將高壓滅菌后的液體石蠟放置在40～60℃溫箱中，使滅菌后的液體石蠟層由乳白色變成無色透明。在無菌條件下，將滅菌除水的液體石蠟用無菌吸管罐到長滿菌絲的斜面試管中，液體石蠟要高出斜面尖端1厘米左右，然后用無毒泡沫試管塞塞好，直立地放在試管架上或罐頭瓶中，置于冰箱或室溫中保藏。液體石蠟灌注過多，移種時不方便；過少，時間長容易干涸。如將棉塞齊試管中剪平，用石蠟溶封，或用無菌橡皮塞代替棉塞，可延長保藏時間。

1.3 濾紙保藏法

在無菌條件下，用干燥的濾紙條收集孢子，然后用鑷子將濾紙條及干燥硅膠放入試管中，并將試管放在真空干燥器中1～2天，除去濾紙條上水分，最后將試管口密封，貼好標簽，置于冰箱保藏，或將濾紙條裝入無菌塑料瓶中，密封保藏。保藏期限可達2～5年。

1.4 真空冷凍干燥保藏法

此法系將菌種同時處于低溫、干燥和缺氧的條件下，使菌種的代謝活動相對靜止，保藏時間可達數年或更長久。其方法是：將需要保藏的菌種或懸浮液，裝在安瓿瓶里后，驟然冰凍，立即抽真空，使其快速脫水而干燥，再溶封后，置于低溫或室溫下保藏。復蘇培養時，可在開啟的安瓿管內注入0.3～0.5毫升的無菌生理鹽水或1%麥芽汁。菌種安瓿瓶開啟時，應先將安瓿瓶的封端加熱，在浸有來蘇爾等消毒液的濕布上擦一下，使管壁形成裂縫，然后再輕輕敲碎。切忌猛烈割斷，以免空氣驟然沖入，導致污染。

1.5 液態氮超低溫保藏法

液氮超過低溫保藏法是把菌種裝在含有冷凍保護劑的安瓿瓶內，將該安瓿瓶放入液氮（-196℃）中進行保藏，由于菌絲體處于-196℃，其代謝降低到完全停止的狀態。所以不需定期移植。液氮超低溫保藏法是菌種長期保藏的最有效最可靠的方法。

1.5.1 菌種制備：菌種在PDA培養基平板上于22～24℃下培養10～15天，菌絲體充分生長后，用打孔器（直徑2～4毫米）切割瓊脂塊，或用手術刀片把菌絲培養物切成2毫米×4毫米長方形小塊。

1.5.2 安瓿管制備：安瓿管的玻璃，要能經受溫度突變而不破裂，容易用火焰熔封管口，恢復培養時容易打開。一般采用硼硅玻璃管，管的大小根據需要而定，通常是75毫米×10毫米或能容1.2毫升液體的安瓿管比較合適。選好安瓿管后，用印油書寫欲保藏的食用菌菌種的菌號于管壁上，160℃干熱滅菌，使印記牢固地固定在管壁上。

1.5.3 保護劑：每管加進0.8毫升高壓滅菌的10%甘油水溶液或10%二甲亞砜水溶液可作為冷凍保護劑。用無菌鑷子將這種帶有菌絲體的瓊脂塊移入加有保護劑的安瓿管中。用火焰將安瓿管上部熔封，浸在水中檢查有無漏氣。

1.5.4 液氮保藏：把已做好的安瓿菌種管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶的底部放一塊鐵片，使塑料瓶連同安瓿管能一起沉入液氮罐中），蓋好瓶蓋，在瓶蓋上連接一條細繩并作記號，以便提出所需的菌種。把裝有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管緩慢地降溫，大約30分鐘后，把安瓿管浸入液氮中進行長期保存。啟用液氮罐中保存的菌種時，應先將安瓿管置于35～40℃的溫水中，使瓶內的冰塊迅速融解，然后在無菌條件下開啟安瓿管，用接種針取菌塊移接于適宜的培養基上，置于22～24℃條件下活化培養。

2 菌種的退化與復壯

2.1 菌種的退化

菌種在傳代過程中，因遺傳物質發生變異而引起的原有的優良性狀漸漸消失或變壞，出現長勢差、出菇遲、產量不高、質量不好、子實體叢生等現象。這些現象人們泛稱為“退化”。“退化”是一個群體概念，既栽培中子實體群體中有少數子實體與親本不同，不能算退化，只有相當一部分乃至大部分個體的性狀都明顯變劣，群體生長性能顯著下降時，才能視為菌種退化。菌種退化是一個漸變的過程，在發生有害變異的個體在群體中顯著增多以至占據優勢時才會顯露出來。因此盡管個體的變異可能是一個瞬時的過程，但菌種呈現“退化”即需要較長的時間。

2.1.1 菌種發生退化的原因：①菌種混雜：在菌種繼代培養過程中，不同品種間交叉感染，導致不同品種的菌絲體混雜在一起，導致原有品種生產性狀的改變，常常表現出產量下降、質量變劣等。②有害突變的發生：一般來說，一個正常菌株經過多代移植，不會導致遺傳性狀的改變。但是如果一個菌株的菌絲體細胞中發生有害突變，而且突變體能適應外界環境條件，那么，隨著移接次數的增加，有害突變體在菌絲細胞群中所占的比例會逐漸增大。這樣，該菌株的生產性能就會隨之惡化，退化現象就逐漸顯現出來。③病毒的感染：菌種感染病毒后，病毒不僅會隨著菌絲體的擴大繁殖而增加，而且會通過帶毒孢子傳染下一代，當菌種攜帶一定濃度的病毒粒子，在栽培中都會表現出明顯減產，菇質量下降等退化現象。

2.1.2 防止菌種退化的措施：①防止菌種的混雜：在菌種轉管、出菇試驗等工作中，均應加強品種隔離，減少品種間的混雜，以保證優良品種的遺傳組成在較長時間內能保持相對的穩定。②控制菌種傳代次數：菌種傳代次數越多，產生變異的幾率就越高，因此菌種發生退化的概率就會越多，生產中應嚴格控制菌種的移接代數。③采用有效的菌種保藏方法保存菌種：菌種保存應是短期、中期和長期三者相結合，根據不同的要求從不同保藏方法中進行轉接，確保菌種能長期保持該品種的原有優良性狀。④創造菌種生長良好營養條件和外界環境：菌種培養基的營養條件應適宜，才能使菌種生長健壯，減少退化的發生。營養不足和過于豐富對菌種生長均不利。菌種的生長繁殖受到物理、化學、生物等外界條件的影響，如條件適宜，菌種生長正常，不易退化；不相適宜，則會引起菌種的退化。⑤防止病毒感染：對菌種可能遭受病毒的感染應保持警惕。及時檢驗有疑問的菌種。淘汰感染病毒菌株，尤其是淘汰病毒粒子含量大、菌絲體及子實體性狀已受到嚴重影響的菌株。

2.2 菌種的復壯

保持菌種的優良性狀及生活力強的特性是保證食用菌優質高產的重要條件。為了避免食用菌優良性狀的退化，必須采取復壯措施。常用的菌種復壯方法如下：

系統選育：生產中選擇具本品種典型性狀的幼嫩子實體進行組織分離，重新獲得生長旺盛、活力強的雙核菌絲。這種方法簡便易行，周期短，生產上易于采用。反復進行無性繁殖，菌種會衰退，定期通過有性孢子分離和篩選，從中優選出具有該品種典型性狀的新菌株，逐漸替代原始菌株，可不斷地使該品種得到恢復。

適當更換培養基：長期在同一培養基上繼代培養的菌種，生活力可能逐漸下降。在菌種保藏傳代中，經常改變培養基成分，或在原有的培養基中添加酵母膏、麥芽汁、氨基酸類物質和維生素等，以刺激菌絲生長，提高菌種活力。

菌絲尖端分離：挑取健壯菌絲體頂端部分，進行純化培養，以保持菌種的純度，使菌種恢復原來的生活力和優良種性，達到復壯的目的。