氮摻雜納米二氧化鈦對3種常見病菌抑菌效果的研究*

閆 磊 盧 怡 陸林杰 王瀟宇 張震芳 蘇 方 白春繼

納米二氧化鈦(TiO2)是一種無機光催化抑菌材料，自1972年日本科學家Fujishima和Honda發現了TiO2在紫外光照射下可以催化降解水的現象以來[1]，研究表明，光催化納米TiO2可通過抑制菌斑獲得性膜的形成、破壞細菌細胞壁、細胞膜以及DNA雙螺旋結構等機制抗菌[2]。

眾所周知，口腔環境中存在大量的微生物，而口腔診療過程中易飛濺血液、唾液，如果感染控制不完善，極易引發院內感染[3]。近年來，隨著納米TiO2技術逐漸向口腔領域的滲透，其廣譜抗菌、凈化空氣等特性的發現為減少醫院獲得性感染，提高口腔感染控制效果奠定了重要基礎。Aita等[4]報道了紫外線照射TiO2植體可有效減少口內細菌附著以及菌斑形成，我國學者研究發現[5]，光催化TiO2：C涂層可有效改善種植體材料的抗菌性，對變形鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌抗菌性強，可改善種植體周圍炎的發生率。此外，光催化納米TiO2對診室醫療設備及環境空氣中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的殺滅率均高達99%以上，對乙肝表面抗原也有破壞作用，并可使內毒素降解，表現出了良好的消毒效果[6]。

但納米TiO2只有在紫外光照射下才能激發產生作用，大大限制了在可見光環境下的應用。本課題組的合作單位北京科技大學在前期研究中使用氮摻雜技術成功制備了氮摻雜納米二氧化鈦(納米N-TiO2)噴劑，使得該材料在可見光照射下即可被激發，突破了這一應用局限[7,8]。

其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌分別是革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的代表菌種，也是醫療環境中物體表面的常見病菌，所以將其作為抑菌試驗的殺滅對象具有代表性[9]。本研究是在實驗室條件下探究納米N-TiO2對以上3種病菌的抑菌效果，為進一步深入研究本材料對其他病菌的抑菌效果和將該材料的實際抑菌應用提供實驗依據。

本實驗所用的抑菌材料氮摻雜納米二氧化鈦(納米N-TiO2)噴劑是成品材料，為測定其真實抑菌性能故要求實驗中不應改變它的性質，同時目前尚無氮摻雜納米二氧化鈦在24h以內的抑菌效果報告，故本實驗根據《消毒技術規范(2012年版)》設計，采用“載體浸泡定量殺菌試驗”和“抑菌環試驗”兩種方法，前者在前期預實驗的基礎上設計0.5、1、2、3、4h共5個時間段進行檢測，后者按該規范進行觀察[10]。

1.材料和方法

1.1 實驗試劑

1.1.1 抑菌劑 納米N-TiO2噴劑(主要有效成分為氮摻雜的銳鈦礦型納米TiO2，平均粒徑＜65nm，噴劑pH=7-8；不溶于水，不溶于稀堿、稀酸，溶于熱濃硫酸、鹽酸、硝酸，相對密度3.8-3.9g/cm2，熱穩定性好，室溫條件下可穩定存儲超過120d以上，由北京科技大學提供)，有效成分是1 wt%(質量分數)的納米N-TiO2懸濁液。

1.1.2 實驗菌株和培養基

(1)金黃色葡萄球菌(CGMCC 1.2465)，培養基為營養肉湯培養基；

(2)大腸埃希氏菌(CGMCC 1.3373)，培養基為LB培養基；

(3)白色念珠菌(CCTCC AY 93025)，培養基為沙氏培養基。

1.1.3 其他試劑

(1)稀釋液：1%胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)；

(2)洗脫液：含0.1%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2 實驗器材

(1)超凈臺：海爾生物安全柜，型號HR40-ⅡA2型，青島海爾醫用低溫科技有限公司；

(2)恒溫培養箱：振蕩培養箱SPX-150B-D型，箱內自帶40w功率日光燈，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

(3)移液器：Genex Beta(20-200μL、100-1000μL)，芬蘭百得實驗室儀器蘇州有限公司；

(4)漩渦混合器：VORTEX-5型，上海書培實驗設備有限公司；

(5)游標卡尺：滬制01130048，上海恒量量具有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 載體浸泡定量殺菌試驗

(1)試驗用菌懸液的制備：取以上菌種24h的新鮮培養斜面，在無菌條件下取單個菌落投入相應的液體培養基中，分別在37℃環境下振蕩培養至一定時間(金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為6 h，白色念珠菌為12 h)，吸取1 mL菌懸液裝入無菌玻璃試管中，稀釋至約為3×108cfu/mL的濃度。

(2)菌片的制備：制備10mm×10mm無菌干燥的脫脂白平紋布片作為載體，吸取10μL稀釋菌懸液滴染于載體，并置于37℃無菌環境下緩慢干燥制成菌片備用。

(3)殺菌試驗：實驗組將菌片輕輕放入裝有5mL納米N-TiO2噴劑的無菌平皿中，并使兩者充分接觸，然后將平皿置于室溫25℃、日光燈照射(日光燈功率40w，平皿距離日光燈約30cm)環境下，作用至預定時間；對照組操作同上，以TPS代替納米N-TiO2噴劑。

(4)培養計數：作用至相應時間后，在無菌環境下將菌片取出，投入裝有5 mL洗脫液的試管中，用漩渦混合器振蕩混合30 s，將菌從載體上洗下獲得菌懸液，然后按照《活菌培養計數技術》進行培養計數。

(5)結果計算：以上試驗重復3次，計算殺滅對數值：

殺滅對數值(KL)=對照組菌落對數值(Na0)-實驗組菌落對數值(Nas)，其中，a為作用時間(h)，0表示對照組，s表示實驗組。

(6)評判標準：殺滅對數值KL≥3者，判定為有抑菌效果；3次結果均有抑菌效果者為消毒合格。

1.3.2 抑菌環試驗

(1)試驗用菌懸液的制備：操作同1.3.1，將菌懸液稀釋至約3×106cfu/mL的濃度。

(2)抑菌試驗樣片的制備：實驗組取直徑為5mm無菌干燥的濾紙片，每片滴加20μL納米N-TiO2噴劑，在37℃無菌環境下干燥后備用；對照組取同樣的濾紙片，每片滴加無菌蒸餾水。

(3)染菌平板的制備：在無菌環境下用無菌棉拭子蘸取1.3.1制備的菌懸液，在相應的固體培養基平板上均勻涂抹3次，每涂抹1次后將平板應轉動60°繼續涂抹，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周，最后蓋好平皿，置室溫干燥5min。

(4)抑菌試驗樣片的放置：每個平板貼放4個實驗組樣片和1個對照組樣片，其中實驗組樣片放在平板四周，對照組樣片放在平板中心。注意樣片的藥液面必須與瓊脂面完全密合，各樣片中心點之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上。貼放完畢后，將培養皿倒置(藥液面接受光照)，置于室溫25℃、日光燈照射(日光燈功率40w，平皿距離日光燈約30cm)環境下培養18h。

(5)結果測量：試驗重復3次。用游標卡尺(精度0.02mm)測量抑菌環的直徑(包括貼片)并記錄。測量抑菌環時，應選均勻而完全無菌生長的抑菌環進行，測量其直徑應以抑菌環外沿為界。

(6)評判標準：實驗組樣片抑菌環直徑＞7mm者，判定為有抑菌效果；抑菌環直徑小于或等于7mm者，判為無抑菌作用；3次重復試驗均有抑菌作用結果者，判定為消毒合格；同時，對照組應無抑菌環產生，否則試驗無效。

2.結果

2.1 載體浸泡定量殺菌試驗 納米N-TiO2噴劑對3種病菌作用0.5，1，2，3，4h，再經培養計數后計算得出的殺滅對數值分別見表1至表3。結果顯示納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌作用1h以及對大腸埃希氏菌、白色念珠菌作用0.5h達到殺滅對數值＞3。

表1 納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌的殺滅對數值

表2 納米N-TiO2噴劑對大腸埃希氏菌的殺滅對數值

表3 納米N-TiO2噴劑對白色念珠菌的殺滅對數值

2.1 抑菌環試驗 實驗組樣片對3種病菌產生的抑菌環直徑見表4至表6，同時對照組樣片均未產生抑菌環。結果顯示，納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌作用18h后產生直徑＞7mm的清晰抑菌環，而對白色念珠菌則未產生抑菌環(圖1-圖3)。

表4 納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌產生的抑菌環直徑(mm)

表5 納米N-TiO2噴劑對大腸埃希氏菌產生的抑菌環直徑(mm)

表6 納米N-TiO2噴劑對白色念珠菌產生的抑菌環直徑(mm)

圖1 納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌產生抑菌環圖注：抑菌環直徑＞7mm

圖2 納米N-TiO2噴劑對大腸埃希氏菌產生抑菌環圖注：抑菌環直徑＞7mm

圖3 納米N-TiO2噴劑對白色念珠菌未產生抑菌環

3.討論

抗菌劑一般分有機抗菌劑、無機抗菌劑和天然抗菌劑。有機抗菌劑抗菌機理主要是與細菌和霉菌的細胞膜表面的陰離子相結合或與巰基反應，破壞蛋白質和細胞膜的合成系統，從而抑制細菌和霉菌的繁殖[11]。有機抗菌劑具有殺菌迅速，殺菌力強等優點，但同時具有殘留物有一定毒性、穩定性差易分解、效果持續時間短等缺點。無機抗菌劑包括重金屬類和光催化類。無機抗菌劑的優點是具有安全性、耐熱性、耐久性、持續性，不足之處是部分材料價格昂貴，不具有有機抗菌劑的速效性[12]。天然抗菌劑大多數是從動植物中提煉精制而成的，使用安全，無毒副作用，但加工困難、耐熱性差。

納米TiO2作為近年來新發現的一種新型無機光催化型抗菌劑，因具有來源豐富、價格低廉、清潔無污染、化學性質穩定[13]受到各國科學家的廣泛關注。納米TiO2主要成分為氮摻雜N-TiO2粉，粒徑在10-15nm,相對密度3.8-3.9g/cm3熱穩定性佳，易去除，廣泛應用于污水處理、空氣凈化、醫藥和化妝品等領域。由于TiO2的禁帶寬度(3.2eV)較大，相當于波長為387nm光的能量[14]，正好處于紫外區，故以納米TiO2作為光催化劑產生光催化氧化反應需要紫外線作為光源。紫外光在太陽光能中只占3%-5%，而占太陽能45%的可見光不能被利用，極大限制了納米TiO2材料的應用環境范圍，因此將納米TiO2的光響應拓寬至可見光區具有重要的研究意義。

迄今國內外研究者對此做了大量工作，如表面光敏化[15]、半導體復合[16]、貴金屬沉積[17]、金屬元素摻雜[18]、非金屬元素摻雜[19]等。北京科技大學曹文斌課題組[20]自2003年開始相關研究，采用同步晶化與氮摻雜工藝制備了氮摻雜納米二氧化鈦粉體，實現了納米粉體的規模化制備，在此基礎上進一步制備了以無機助劑為分散系的納米N-TiO2噴劑。本產品可以高效利用室內波長在520nm以下的自然光線，在室內自然光照射環境下將光能轉化為化學能，使納米N-TiO2表面發生電子躍遷，躍遷產生的電子和空穴在納米材料表面與所吸附的氧氣和水反應，產生大量羥基自由基(·OH)和超氧自由基(O2-)，這兩種基團具有很強的化學反應活性，足以將構成蛋白質等有機物的C-H、C-O、C-N等化學鍵分解，最終生成無毒無味無污染的二氧化碳(CO2)、水(H2O)及一些簡單的無機物，故而能夠連續破壞與之接觸的細菌的細胞壁和細胞膜，使細菌喪失了受損的細胞壁和細胞膜的修復功能，引起細胞內容物的流失，最終導致細胞死亡，達到殺滅或抑制細菌的目的[21]。納米N-TiO2在起到殺菌作用的同時自身作為催化劑并不發生任何變化，反應的分解產物也不會產生二次污染，具有長效持久、綠色無污染的突出優點。

本研究的目的是為了檢測成品材料納米N-TiO2噴劑對3種代表病菌的抑菌效果，只有在盡量不改變噴劑的各項理化性質的前提下才能反映噴劑的真實抑菌性能。故選用“載體浸泡定量試驗”和“抑菌環試驗”這兩種方法，由于前者的試驗結果具有定量比較性，后者則具有直觀比較性。

“載體浸泡定量試驗”的結果顯示，在該試驗條件下納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌分別作用1h、0.5h、0.5h即能達到消毒效果，對三種病菌的抑菌效果依次為金黃色葡萄球菌＜大腸埃希氏菌＜白色念珠菌。“抑菌環試驗”的結果顯示，在該試驗條件下納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌具有明顯的抑菌效果，對白色念珠菌不具有抑菌效果。由此可見，納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌的試驗結果是一致的，但對于白色念珠菌來說結果卻不太一致。

白色念珠菌屬于真菌，真菌具有雙相性，可以在不同條件下以酵母相或菌絲相為主存在。有研究表明，真菌的表型轉換是其重要的致病因素，菌絲的形成使真菌更易入侵和逃避宿主的免疫防御[22]，而真菌菌絲的形成與諸多因素有關，如培養基成分、溫度、CO2誘導劑、真菌孢子濃度[23,24]等。為了初步驗證涂板的真菌菌液濃度對抑菌環大小的影響，以大腸埃希氏菌為參照，在“抑菌環試驗”中將涂板的大腸埃希氏菌、白色念珠菌濃度稀釋在原試驗的基礎上再稀釋10倍，結果仍舊同前一致，對大腸埃希氏菌平板產生了大于7mm的抑菌環(圖4)，對白色念珠菌平板依舊不產生抑菌環(圖5)。根據以上試驗結果，猜測由于納米N-TiO2的光催化抑菌效果相對有機抑菌材料來講比較緩慢，在“抑菌環試驗”中光催化反應初期產生的羥基自由基(·OH)和超氧自由基(O2-)，無法完全殺滅所接觸到的所有白色念珠菌，同時又可能促使一定比例的真菌體在這種刺激下從抗性較弱的酵母相轉化為抗性很強的菌絲相，由于和培養瓊脂緊密接觸的菌體可以獲得充足的營養來源，以致光催化殺滅作用無法繼續殺滅試驗樣片周圍一定范圍內的剩余菌絲相白色念珠菌，待白色念珠菌培養到一定時間后即能在肉眼狀態下可見瓊脂板上沒有產生抑菌環。金黃色葡萄球菌的細胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸，大腸埃希氏菌則具有由肽聚糖組成的細胞壁，帶有鞭毛具備一定的運動能力，但通過上述試驗證明這兩種細菌的細胞壁結構顯然在羥基自由基(·OH)和超氧自由基(O2-)的強氧化能力下即可被破壞致細菌死亡。在“抑菌環試驗”中觀察到納米N-TiO2對白色念珠菌未產生抑菌環，并不能說明納米N-TiO2對白色念珠菌無消毒效果，“載體浸泡定量試驗”中由于病菌完全浸泡在納米N-TiO2噴劑內，無充足營養來源，其結果顯示納米N-TiO2對白色念珠菌的殺滅能力反而比對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌還要強。

圖4 納米N-TiO2噴劑對大腸埃希氏菌產生抑菌環圖注：抑菌環直徑＞7mm

圖5 納米N-TiO2噴劑對白色念珠菌未產生抑菌環

通過本研究，確定了納米N-TiO2噴劑對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌均具有良好的抑菌效果，在不同的實驗環境中對不同病菌效果的抑菌效果也是有差異的。北京科技大學曹文斌課題組[25]研發納米N-TiO2可拓寬TiO2光響應范圍，提高光催化率及抑菌效率[26]。本課題組前期進行了納米N-TiO2的體外細胞毒性研究，初步證實納米N-TiO2具有人體應用的生物安全基礎[27]，又通過研究證實了納米N-TiO2噴劑對口腔科光固化燈光導棒具有很強的消毒作用[28]。本次實驗采用功率為40W的日光燈模擬室內自然光作為光源，在本條件下進行的實驗結果為納米N-TiO2的在室內可見光環境下的廣泛應用提供了實驗依據。需要注意的是，要將本材料在臨床中進一步推廣應用，還涉及到對其他醫院環境污染病菌的抑菌效果、材料的生物安全性以及在實際環境中多種病菌污染、其他有機物干擾、氣溫濕度影響等情況下的消毒效果等問題，需要在以后繼續開展研究逐步解決。

[1] Fujish ima A.TiO2Photocatalysis and Related Surface Phenomena[C].the 60th annual meeting of the international society of electrochemistry.2009

[2] Xing Y,Li X,Zhang L,et al.Effect of TiO2nanoparticles on the antibacterial and physical properties of polyethylenebased film[J].Progress in Organic Coatings,2012,73(2-3):219-224

[3] Tamma PD,Srinivasan A,Cosgrove SE,et al.Infectious Disease Clinics of North America.Antimicrobial stewardship.Preface[J].Infect Dis Clin North Am,2014,28(2):xi

[4] 麥理想,張 晟,王春陽,等.納米TiO2:C薄膜涂層的構建及對大腸桿菌的抗菌性能研究[J].中山大學學報(自然科學版),2011,50(6):82-87

[5] Aita H,Hori N,Takeuchi Met al.The effect of ultraviolet functionalization of titaniu m on integration with bone[J].Biomaterials,2009,30(6):1015-1025

[6] Li Y H,Cao W B,Wei Y,et al.Preparation of Nitrogendoped Nano-TiO2Powders[J].Journal of Inorganic Materials,2006,21(5):1067-1072

[7] Xu J,Liu Q,Lin S,et al.One-step synthesis of nanocrystalline N-doped TiO2powders and their photocatalytic activity under visible light irradiation[J].Research on Chemical Intermediates,2012,39(4):1655-1664

[8] Liu W X,Jiang P,Shao W N,et al.A novel approach for the synthesis of visible-light-active nanocrystalline N-doped TiO2photocatalytic hydrosol[J].Solid State Sciences,2014,33(24):45-48

[9]YouC,HanC,WangX,et al.Theprogressofsilver nanoparticles in the antibacterial mechanism,clinical application and cytotoxicity[J].Molecular Biology Reports,2012,39(9):9193-9201

[10]衛生部衛生與法規監督司.消毒技術規范[S].北京：中華人民共和國衛生部,2002:45-75

[11]趙 欣,朱健健,李 夢.我國抗菌劑的應用與發展現狀[J].材料導報,2016,30(7):68-73

[12]Mahdavi H,Rahmani O,Shahverdi AR.Polyacrylamide/reduced graphene oxide-Ag nanocomposite as highly efficient antibacterial transparent film[J].Journal of the Iranian Chemical Society,2016:1-10

[13]Nan B.N-doped TiO2:Preparation by Hydrothermal Reaction-thermolysis Process and Photocatalytic Activity[J].Chinese Journal of Inorganic Chemistry,2007,23(1):101-108

[14]Foster H A,Ditta I B,Varghese S,et al.Photocatalytic disinfection using titanium dioxide:spectrum and mechanism of antimicrobial activity[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2011,90(6):1847-68

[15]梅樂夫,梁開明.氮摻雜TiO2-ZrO2復合光催化薄膜的研究[J].稀有金屬材料與工程,2008,37(5):758-761

[16]Li H,Bian Z,Jian Z,et al.Mesoporous Au/TiO2nanocomposites with enhanced photocatalytic activity[J].Journal of the American Chemical Society,2007,129(15):4538-4539

[17]Tieng S,Kanaev A,Chhor K,et al.New homogeneously doped Fe(III)-TiO2photocatalyst for gaseous pollutant degradation[J].Applied Catalysis A General,2011,399(1):191-197

[18]吳雪煒,吳大建,劉曉峻.硼(氮、氟)摻雜對TiO2納米顆粒光學性能的影響[J].物理學報,2010,59(7):4788-4793

[19]Xu J,Wang F,Liu W,et al.Nanocrystalline N-Doped Powders: Mild HydrothermalSynthesisand Photocatalytic Degradation of Phenol under Visible Light Irradiation[J].International Journal of Photoenergy,2013,2013(2013):937-942

[20]司家文，胡啟凡，孫惠強.種植體表面抗菌涂層技術[J].口腔頜面修復學雜志,2011,12(2):119-122

[21]Monteoliva L,Martinezlopez R,Pitarch A,et al.Quantitative proteome and acidic subproteome profiling of Candida albicans yeast-to-hypha transition[J].Journal of Proteome Research,2011,10(2):502-517

[22]I˙lknur Tatl?dil,Münevver S?kmen,ChrisBreen,et al.Degradation of C andida albicans,on TiO2,and Ag-TiO2,thin films prepared by sol－gel and nanosuspensions[J].Journal of Sol-Gel Science and Technology,2011,60(1):23-32

[23]Ibrahim H M M,et al.Photocatalytic degradation of methylene blue and inactivation of pathogenic bacteria using silver nanoparticles modified titanium dioxide thin films[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2015,31(7):1049-1060

[24]吳紹熙,郭寧如.真菌的分子生物學[J].中國真菌學雜志,2007,2:231-239

[25]曹文斌,許軍娜,劉文秀,等.可見光活性氮摻雜納米二氧化鈦研究進展[J].材料工程,2015,43(3):83-90

[26]張小寧,曹文斌,李艷紅,等.氮摻雜納米TiO2改性涂料及其抗菌性能[J].中國涂料,2005,20(11):26-28

[27]唐曉君,施生根,盧 怡.氮摻雜納米TiO2抗菌劑的體外細胞毒性研究[J].口腔頜面修復學雜志,2014,15(5):269-273

[28]唐曉君,施生根,盧 怡,等.氮摻雜納米二氧化鈦對光固化燈光導棒消毒效果的研究[J].實用口腔醫學雜志,2015,31(3):331-334