人源化SCID-beige鼠模型的建立及口腔鱗癌荷瘤模型建立*

任儀鵬 張 蕾 史悅怡 步榮發(fā)

人源化小鼠模型(Humanized Mouse Model)是指帶有功能性的人類基因、細胞或組織的小鼠模型。這種模型通常被用做人類疾病體內研究(in vivo study)的活體替代模型。

口腔鱗癌的免疫治療[1]已經(jīng)是目前的研究熱點。雖然動物自身的免疫系統(tǒng)和人類存在相似點，但是區(qū)別也非常大。所以需要建立一種可以在一定程度上模擬人類免疫狀態(tài)的動物模型。這種模型介于動物模型和人體臨床試驗之間，具有明確的免疫缺陷并允許人類免疫細胞在其體內移植及擴增。在以往的口腔鱗癌動物試驗中最常使用的是缺少T細胞的裸鼠，可是在構建人源化動物模型和進行免疫相關研究方面卻并不可靠。SCID-beige鼠是一類免疫重度缺陷的小鼠，可用于人源化小鼠模型的建立。本研究的目的就在于建立人源化SCID-beige鼠模型并將其應用于口腔鱗癌免疫研究之中，初步評估其建模效果。

1.材料和方法

1.1 試驗動物及細胞 SCID-beige鼠30只，購于北京維通利華實驗動物技術公司。4-5周齡，體重20g-25g，雌、雄性均可。在解放軍總醫(yī)院動物實驗中心無菌層流條件下飼養(yǎng)，水、食物及填料均高壓滅菌。飼養(yǎng)溫度22℃，濕度55%，12小時白/晝節(jié)律。整個實驗的過程都需要在無菌條件下進行。

腫瘤細胞系：為了評估的全面性，選用了三株常用的人舌鱗狀細胞癌細胞系，TCA8113、SCC9、SCC25。

人外周血淋巴細胞(PBL)：來源于解放軍總醫(yī)院輸血科健康獻血者外周靜脈血。

1.2 細胞培養(yǎng) TCA8113、SCC9、SCC25細胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基(10%熱滅活新生牛血清，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀態(tài)換液傳代。傳代及試驗前需用0.25%胰蛋白酶溶液消化。

1.3 Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型的建立

1.3.1 分離人外周血淋巴細胞 全血常規(guī)操作分離成分血后，無菌提取剩余血液成分回實驗室處理；血與淋巴細胞分離液按1∶2比例混合；1500r/min離心15min；用膠頭滴管先吸棄血漿層，再吸取白膜層至另一離心管中；加入生理鹽水至總量40-45ml并混勻后，300g離心10min洗去分離液；重復洗滌1次；計數(shù)細胞并用生理鹽水調整細胞密度至3×107/200ul待用。

1.3.2 PBL小鼠腹腔注射 當日新鮮分離的PBL細胞懸浮在生理鹽水中，按照100μl/10g(體重)的標準，經(jīng)腹腔注射200μl，共3×107個/只。

1.3.3 免疫重建后小鼠外周血免疫球蛋白的測定 4周后取小鼠尾靜脈血，凝固后取血清。按照檢測人免疫球蛋白定量試劑盒(IgG)的操作說明操作。

1.4 皮下荷瘤模型的建立 取上一步驟中可以檢測出人IgG的小鼠，隨機分為三組：1、TCA8113組；2、SCC9組；3、SCC25組。每組10只。首先檢測三組IgG水平，分析沒有組間差異后繼續(xù)后續(xù)步驟。

收獲對數(shù)生長期的TCA8113、SCC9以及SCC25細胞，分別制成單細胞懸液，生理鹽水洗滌2次，臺盼藍染色后計數(shù)細胞，活細胞數(shù)大于95%，用生理鹽水調整活細胞濃度為2.5×107/mL。將三種細胞懸液分別注射于小鼠背部皮下，每只小鼠注射100μL，即2.5×106個/只，無菌環(huán)境下飼養(yǎng)。密切觀察小鼠成瘤情況，當腫瘤長至能測量后，每隔4日用游標卡尺測量皮下腫瘤長徑和短徑，用下列公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(cm3)＝長徑×短徑2×1/2。于接種腫瘤細胞4-6周(如腫瘤生長快速可在4周后)，乙醚麻醉后，摘眼球放血處死，分別取三組小鼠的腫瘤組織進行后續(xù)檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用chiss2004軟件，進行組間差異的方差分析，然后SNK檢驗法進行組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義的差異。

2.結果

2.1 Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型的建立 全部小鼠外周血中均可檢測到human-IgG，濃度較高，平均達2.105g/L，成功建立了Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型(圖1)，重建成功率100%。對小鼠進行隨機分組后，統(tǒng)計結果顯示組間IgG含量沒有差異(圖2)。

2.2 移植瘤模型的建立和腫瘤體積 分別將TCA8113、SCC9以及SCC25細胞于皮下接種小鼠，7-10d開始有瘤結節(jié)形成，成瘤率95%。之后腫瘤呈進行性生長。測量腫瘤生長速度組間無明顯區(qū)別(圖3)。最終腫瘤體積差異無統(tǒng)計學意義，Tca8113組 2.858cm3±1.188cm3、SCC9組2.119cm3±1.032cm3、SCC25 組 2.693cm3±1.152cm3(圖4)。其中我們對TCA8113細胞移植瘤進行了病理切片檢查，并與裸鼠移植瘤切片進行了對比，發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)沒有出現(xiàn)特異性改變(圖5)。

圖1 資料SCID-beige鼠(建立移植瘤模型后，腫瘤部位如箭頭所示)

圖2 ELISA法檢測小鼠體內human-IgG含量，三組差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

圖3 三組移植瘤生長趨勢相似

圖4 小鼠處死前測量腫瘤體積差異不具有統(tǒng)計學意義，P＞0.05

圖5 TCA8113細胞移植瘤形態(tài)無明顯差異

3.討論

以往的生命科學研究中最常使用的免疫缺陷模型是裸鼠，但是裸鼠體內雖然缺少T細胞，可是卻具備有功能的B細胞和NK細胞，人類腫瘤可以成功移植到裸鼠,但是正常的人類細胞卻為裸鼠所排斥。而SCID小鼠因為體內同時缺少T細胞和B細胞，從而成為了建立人源化動物模型的理想選擇。自從1988年Mosier成功報導了將人外周血單核細胞(PBMC)輸注給重度免疫缺陷鼠(SCID)鼠體內，并檢測到人淋巴細胞的存在并具有生物學功能，后來，這種方法已廣泛應用于癌癥生物學，自身免疫，變態(tài)反應，傳染和移植生物學等方面研究。

雖然具備以上優(yōu)勢，但SCID小鼠象裸鼠一樣，其體內還殘留有NK細胞，巨噬細胞，嗜中性粒細胞等。并且在后天飼養(yǎng)過程中會重新出現(xiàn)免疫系統(tǒng)，也就是容易發(fā)生“免疫滲漏”。所以，為了使SCID小鼠固有的天生免疫系統(tǒng)失效，又將其與另外一種突變種小鼠beige鼠進行雜交[2]。由此獲得的SCID/beige小鼠表現(xiàn)為T和B細胞功能缺陷且NK細胞功能和吞噬作用嚴重減弱[3]，其發(fā)生“免疫滲漏”的機率很低，且不會隨著鼠齡的增加而上升。

SCID/beige雙重突變型小鼠同時具有T/B細胞和先天性免疫系統(tǒng)缺陷，影響了NK細胞和吞噬細胞功能。因此，移植入小鼠體內的人PBMC成功率大為提高，雖然人B細胞還不能出現(xiàn)在小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中，但是PBMC已經(jīng)能夠出現(xiàn)在淋巴器官中并且可以在血液中檢測到人IgG水平的表達。因此，SCID/beige成為了一種很好的可以在體內進行人類免疫系統(tǒng)研究及其它疾病研究的動物模型。

建立人源化免疫動物模型的方式也有很多種，主要的有兩種：(1)干細胞移植方式，這種方法雖然精確，但構建模型較慢[4]；(2)移植完全分化的人外周血細胞的方式[5]。本研究中我們采用了第二種方法，不僅是因為其快速構建人源化小鼠的快速方便，還因為這種方式可以更加準確的反應健康供者的免疫記憶狀態(tài)。

本研究中為了更加接近人體內狀況，采用了SCID/beige鼠以及人PBL腹腔注射的方法來構建hu-PBL-SCID-beige模型，模擬人的免疫環(huán)境。值得指出的是既往很多研究中小鼠重建免疫模型之前都要經(jīng)過預處理，如為尾靜脈注射抗NK細胞活性制劑，重建前進行亞致死劑量的放射線照射等[6,7]。目的都是降低免疫滲漏的發(fā)生率，提高重建成功的比率，但是即使如此目前仍然有著較高的重建失敗率。將SCID-beige小鼠用于免疫重建則無需這些難以控制的步驟[8]。本研究同樣未采取重建前處理措施，最終構建人源化小鼠免疫模型成功率100%，所有小鼠血液中均可檢測出人免疫球蛋白的表達，并且水平較高。成功建立了hu-PBLSCID-beige模型。接著又采用了三種較常見的人舌癌細胞系進行腫瘤種植實驗，結果提示均可成功建立種植瘤模型。目前國內外將人源化小鼠模型作為頭頸腫瘤研究動物模型的方法較少，本次實驗為此領域的應用和研究進行了初步探索，為今后模擬人體免疫環(huán)境并研究OSCC及免疫治療方法提供了新的選擇和參考。

[1] 任儀鵬,步榮發(fā),張 蕾,等.腫瘤微環(huán)境中的相關免疫細胞[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志,2011,9(6):361-364

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[3] Mosier D E,Stell K L,Gulizia R J,et al.Homozygous scid/scid;beige/beige mice have low levels of spontaneous or neonatal T cell-induced B cell generation[J].Journal of Experimental Medicine,1993,177(1):191-194

[4] Lapidot T,Pflumio F,Doedens M,et al.Cytokine stimulation of multilineage hematopoiesis from immature human cells engrafted in SCID mice[J].Science,1992,255(5048):1137-1141

[5] Jr M K,Roychowdhury S,Bhatt D,et al.Anti-human CTLA-4 monoclonal antibody promotes T-cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model:a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies[J].Blood,2005,105(3):1114-1120

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[7]Pearson T,Greiner D L,Shultz L D.Humanized SCID mouse models for biomedical research[J].Current Topics in Microbiology&Immunology,2008,324(324):25-42

[8] Lu Z,Pang M,Dong S,et al.The establishment of human esophageal cancer model in Hu-PBL-SCID mice[J].Cancer Research&Clinic,2015,27(6):381-384