淡水養殖環境中氨氧化微生物的研究進展

黃曉麗，陳中祥，湯施展，吳松

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

淡水養殖環境中氨氧化微生物的研究進展

黃曉麗，陳中祥，湯施展，吳松

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

隨著水產養殖業的快速發展，養殖水體氮素污染日益突出，硝化微生物在水產養殖環境氮循環中具有重要作用。本文主要綜述我國淡水養殖環境中硝化微生物的多樣性、作用機理、厭氧氨氧化過程和機理等研究進展，并展望今后的研究工作：（1）淡水養殖水域硝化作用和氨氧化微生物的時空分布特征及影響因子；（2）淡水養殖環境氨氧化微生物及其他氮素轉化關鍵微生物的過程與機理；（3）深入研究特定生態系統中如池塘生態系統、氮循環的各個過程，構建相關氮素轉化和氮素平衡模型，為完善淡水池塘生態系統氮循環理論、水產養殖環境的氮素污染治理和生態修復提供參考。

淡水養殖環境；氮循環；氨氧化微生物；厭氧氨氧化；養殖池塘

大規模高密度水產養殖造成的養殖水體污染、區域生態環境惡化等問題日益突出。氮素是水產養殖過程中的主要污染物，來源于殘餌及養殖生物的排泄物。當氮素濃度超過水體自凈能力時，易引起水體富營養化，對養殖生物產生毒性作用。因此，降低氮素污染物的濃度是水產養殖業健康持續發展的關鍵。水體對氮素污染物的自凈能力主要取決于氮素轉化微生物的作用。活性氮轉化為氮氣的過程主要由微生物驅動的硝化作用和反硝化作用實現，而硝化作用的微生物代謝包括兩部分，即由氨氧化微生物驅動的氨氧化作用和由亞硝酸鹽氧化菌驅動的硝化作用。氨氧化作用是整個過程的限速步驟，是全球氮循環的中心環節[1]。過去一直認為，驅動氨氧化過程的微生物為氨氧化細菌（ammonia oxidizingbacteria，AOB）。然而，厭氧氨氧化（anaerobic ammonia oxidation，anammox）細菌和氨氧化古菌（ammonia oxidizing archaea，AOA）的發現打破了人們對傳統氮循環模式的認識。大量研究表明，這兩類細菌廣泛存在于海洋水體及底泥、河流、湖泊、稻田、熱泉等各個系統中[2-5]，是全球氮循環重要參與者，其生態學功能受到了廣泛的關注。目前，已證實在漁業水域中存在anammox細菌和AOA，參與水產養殖環境中的氮循環。本文主要綜述了我國近年來水產養殖環境中氨氧化微生物生態學研究進展。

1 氨氧化細菌與氨氧化古菌

1.1 生態分布

氨氧化細菌（AOB）是變形菌綱中的一類化能自養細菌，通過氧化NH3獲得能量。過去認為，由微生物參與的氨氧化過程均由AOB以氧原子作為電子受體進行的好氧氨氧化過程。2005年，Venter等在海藻的宏基因組文庫中發現新的泉古菌氨單加氧酶基因（amoA）序列[6]，Treusch等在土壤宏基因組片段中也發現泉古菌的amoA基因[7]，證明了AOA的存在。這兩類微生物的基因組中都存在一種能夠編碼好氧氨氧化過程的關鍵酶—氨單加氧酶的基因，又稱氨單加氧酶基因amoA，該基因可作為氨氧化微生物特異的分子標記。

近年來，AOA與AOB群落在不同生境中的分布規律一直是氨氧化微生物生態學研究的熱點。我國研究者也研究了不同環境沉積物或土壤，包括太湖竺山灣沉積物[8]、白洋淀濕地[9,10]、洞庭湖岸邊帶[11]、太湖和巢湖沉積物[12]、東湖[13]及淡水養殖池塘底泥中的AOA與AOB。高利海等證實了對蝦養殖池塘底泥中存在AOA[14]。馬少杰等研究了南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）養殖池塘底泥中AOB的多樣性和種群分布，發現池塘周邊土壤中AOB的數量最多，其次是池塘底泥和水體[15]。對中國水產科學研究院池塘生態工程研究中心的武昌魚（Megalobrama amblycephala）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）等混養池塘表層底泥（0～10cm）的研究表明，AOA的數量大于AOB，但AOA amoA基因的表達活性低于AOB，兩者的多樣性隨著底泥深度的增加而降低[16]。AOA和AOB群落結構受季節影響較為明顯。蟹蝦混養池塘AOA和AOB的多樣性指數和均勻度指數均在8、9月時最低[17]。四大家魚養殖池塘底泥中氨氧化微生物amoA基因最高濃度出現在夏季和秋季[18]。草魚池塘表、底層水體AOB amoA基因拷貝數夏季顯著高于春、秋兩季，春季、秋季無顯著差異[19]。

1.2 氨氧化細菌與氨氧化古菌的系統發育

在自然環境中，氨氧化微生物的分布隨生境和生態位而異，即不同生境中同一類氨氧化微生物的優勢類群不同。16SrRNA基因序列系統發育分析表明，所有的AOB均屬于變形菌綱的β亞綱和γ亞綱。β-變形菌綱的AOB在自然環境中處于優勢地位。目前，AOB分為五個屬：亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus）、亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）和亞硝化球菌屬（Nitrosococcus）[20]。武昌魚、草魚等混養池塘表層底泥中的AOB均屬于亞硝化螺菌屬和亞硝化單胞菌屬[16]。南美對蝦養殖池塘底泥中AOB所有序列都屬于亞硝化單細胞菌屬及 Nitrosomonas-like，未發現亞硝化螺菌屬[14]。馬少杰等發現，池塘底泥中亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas sp.）為AOB的優勢種群，池塘周邊土壤中AOB的優勢種群則為Nitrosospira sp.[15]。

AOA的生態位比AOB寬[21]，更適應于持久的貧養條件帶來的能源壓力[22]。古菌分為泉古菌門（Crenarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeota）、初古菌門（Korarchaeota）、納米古菌門（Nanoarchaeota）和奇古菌門（Thaumarchaeota）[23]。在奇古菌門中，Group I分枝最為廣泛和常見，包括Group I.1、Group I.2和Group I.3等幾個分支，Group I.1又分為Group I.1a、Group I.1b和Group I.1c三支[24]。其中，Group 1.1a主要分布于海洋環境；Group I.1b和I.1c主要分布于土壤和陸地環境。在武昌魚和草魚混養池塘0～2 cm深度底泥中的 AOA屬于 Nitrososphaera屬，而10～15cm和20～25cm深度底泥中的AOA屬于Nitrosopumilus屬[16]。蟹蝦混養池塘水體中的AOA絕大多數屬于Nitrosopumilus屬[17]。淡水蝦養殖塘中，除了一個OTU序列屬于未分類的古菌（Unclassified-Archaea）外，其他均屬于泉古菌門[14]。

1.3 氨氧化細菌與古菌對環境因子的響應

近年來，部分氨氧化微生物生態學研究聚焦于氨氧化微生物對環境因子變化的響應。氨氧化微生物的分布差異反映了微生物對環境因子變化的響應與調控。對不同深度池塘底泥中的氨氧化微生物的研究表明，隨著深度的增加，AOB數量逐漸減少，深層底泥中仍可發現AOA[16]。這說明底泥中AOB更適應較高濃度的底物條件，而AOA則在貧營養條件下更占優勢。覃雅等[19]發現，池塘表、底層水體AOB amoA基因拷貝數均與溫度、總磷呈顯著正相關，表層AOB amoA基因拷貝數與總有機碳呈極顯著負相關。此外，氨氮、硝態氮、總氮與亞硝態氮數量也影響AOB的數量與分布。王萃等[25]發現，密云水庫底泥沉積物和庫濱帶土壤中AOB的多樣性和數量差異較大，沉積物中AOB的多樣性指數最低，而農田土壤中AOB多樣性指數最高。在沉積物和水陸交錯帶土壤中，AOB的優勢種與成正相關關系，而在陸相土壤和農田土壤中AOB的優勢種與這些環境因子成負相關。抗生素類物質對AOA和AOB生長和群落結構的影響研究表明，氯霉素對AOB群落結構影響較大，恩諾沙星和磺胺嘧啶對群落結構影響不大，然而這三種抗生素對AOA的群落結構影響均不明顯[2 6]。

2 厭氧氨氧化細菌

20世紀90年代，荷蘭Delft技術大學研究人員在中試規模的厭氧反硝化流化床中，首次發現了一類能夠在厭氧或缺氧條件下以亞硝酸鹽為電子受體氧化銨鹽最終產生氮氣（N2）和少量硝酸鹽的細菌，此類細菌被稱為厭氧氨氧化細菌（anammox）[27]。2002年首次證實，anammox細菌存在于丹麥沿海底泥中，海洋損失的24%～67%氮由該菌作用所致[28]。隨后在黑海和哥斯達黎加GolfoDulce海灣內的兩個缺氧水域中也發現了該細菌[2]。結果表明，有19%～35%的氮氣生成與anammox作用有關。這些發現使anammox細菌獲得了學界廣泛關注。之后，陸續在海底底泥、海口、海水低氧區、內港與海灣、極地海冰、熱泉和深海熱泉噴口、湖泊、河流底泥及稻田濕地等區域中發現了anammox[29]。對池塘底泥中厭氧氨氧化作用的研究證實，養殖池塘沉積物中存在anammox[30]。Shen等利用16SrRNA基因測序技術、qPCR技術和15N同位素示蹤技術證實了不同淡水養殖池塘底泥中存在anammox。qPCR結果表明，底泥中Anammox拷貝數為5.6×104～2.1×105拷貝·g-1[31]。對青島城陽養殖場夏季和冬季不同養殖品種魚類和蝦類池塘沉積物中anammox菌群結構、多樣性和豐度的研究[32]表明，養殖區沉積物中anammox的多樣性不高，養殖環境和季節等對環境中anammox的菌群結構具有顯著影響。Zhang等[33]的研究也表明，陽澄湖養殖區底泥中anammox細菌的群落結構受季節影響明顯，10月底泥中anammox的多樣性、均勻度和豐度均明顯高于1月。

Anammox屬于浮霉菌門，目前已發現5個候選屬：Brocadia、Kuenenia、Anammoxoglobus、Jettenia和Scalindua。不同生境中anammox的優勢類群不同。在海洋底泥和水體中的種群較為單一，基本均屬于耐鹽能力較強的Scalindua屬[3]。在河口等海陸作用劇烈、生態結構較為復雜的區域和不同陸地生態系統（包括沼澤、受污染的孔隙含水層、凍土和農田土壤）中，anammox的分布呈現出多樣性，存在Brocadia、Kuenenia、Jettenia和Scalindua多個屬。天然淡水生態系統中anammox分布沒有明顯規律，有Scalindua、Brocadia、Kuenenia多個屬[10,34]。新沂河底泥樣品中含有與已知厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadiaanammoxidans相似性為91%的16S rRNA基因，經鑒定為厭氧氨氧化菌Brocadia分支的新種類。樣品中還含有組成Planctomycetes新分支的16SrRNA基因。它們與已知厭氧氨氧化菌序列的遺傳距離較遠，其微生物特性還有待進一步研究[35]。Shen等[31]研究發現，淡水養殖池塘底泥中的anammox屬于 Brocadia、Kuenenia和 Anammoxoglobus屬，其中Brocadia為優勢種群。Zhang等[33]發現，陽澄湖底泥中anammox的所有序列與Jetteniagenera相似性為91%。

Anammox細菌在自然環境中的分布差異體現了微生物對環境因子變化的響應。在海洋底泥中和海水水體低氧區中，有機質含量濃度、鹽度等是影響anammox反應的主導因素[4]。在其他生態系統中，環境中氧含量等底物濃度和其他理化指標顯著影響anammox的生產速率[36,37]。在河口和海岸帶，anammox速率往往隨著無機N濃度的下降而從岸邊地帶向深海區遞減。在土壤樣品中，只在一定深度范圍內才分布有anammox[38]，環境因子（如土壤的含水率和氮素含量等）決定了其存在與否以及種群結構和多樣性水平[39]。目前，關于淡水養殖環境中anammox細菌對環境因子響應的相關研究較少。Zhang等利用統計學分析發現，底泥間隙水的濃度及 TOC/TN是影響anammox細菌群落結構的主要因素。皮爾森系數分析表明，anammox細菌的豐度與底泥間隙水的TN、和濃度正相關，而與TOC/TN比值負相關[33]。

3 展望

綜上所述，通過分子生態學、同位素示蹤等技術，學者們對漁業水域特別是水產養殖環境中的氮循環及其微生物過程已有不少認識，豐富了對養殖環境中氮素循環過程和機理的認識。然而，人們對淡水養殖環境中的氨氧化過程和機理的認識和研究水平還不夠深入。建議在淡水養殖環境中氮素轉化微生物的生態學研究中，應重點研究：（1）淡水養殖水域硝化作用和氨氧化微生物的時空分布特征及影響因子；（2）淡水養殖環境氨氧化微生物及其它氮素轉化關鍵微生物的過程與機理；（3）在特定生態系統中如池塘生態系統中，氮循環的過程，構建相關氮素轉化和氮素平衡模型。

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Research Progress of Ammonia-oxidizing Microorganisms in Freshwater Aquaculture：A Review

HUANG Xiao-li,CHEN Zhong-xiang,TANG Shi-zhang,WU Song
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

The rapid development of intensive aquaculture bears risks of environmental issues such as anthropogenic nitrogen pollution.In the past decade,some progress has been made on the nitrogen cycle in aquaculture,diversity and mechanisms of nitrifying microorganisms,and anaerobic ammonia oxidation（anammox）process and mechanisms.In this paper we review the available knowledge concerning the research progress in nitrifying microorganisms in freshwater aquaculture in China,and briefly introduce the researches on anammox bacteria in freshwater aquaculture environment，and then present the future perspectives on this research field. The following areas are suggested to be focused on:（1）to carry on investigations on the spatial-temporal variations in nitrification processes and nitrifying microorganisms in freshwater fishery waters and affecting factors;（2）to search for the processes and mechanisms of ammonia-oxidizing microorganisms and other nitrogen transformation microorganisms;（3）to find out each process of nitrogen cycle,and to build models to predict nitrogen transformation and balance in aquaculture ponds.These studies are expected to provide scientific basis for nitrogen cycle theory and nitrogen pollution control in aquaculture pond ecosystems.

freshwater aquaculture environment;N cycle;ammonia oxidizing microorganism;anammox;culture pond

X172

A

2016-08-22

黑龍江水產研究所中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（HSY201606）；城市水資源與水環境國家重點實驗室開放基金課題（ES201604）.

黃曉麗（1986-），博士，助理研究員，從事漁業環境保護與生態修復研究.E-mail:huangxiaoli@hrfri.ac.cn

1005-3832（2017）01-0052-05