蛋殼殘留蛋清中溶菌酶高效提取技術的研究

李逢振

（湖南環境生物職業技術學院生物工程學院，湖南衡陽 421005）

蛋殼殘留蛋清中溶菌酶高效提取技術的研究

李逢振

（湖南環境生物職業技術學院生物工程學院，湖南衡陽 421005）

蛋殼殘留蛋清占蛋殼質量的27.6%～30.8%，蛋清中含有0.2%～0.4%的溶菌酶。通過一系列的分離提取工藝可從蛋清中獲取溶菌酶。溶菌酶是一種天然蛋白質，對人體無毒害作用，且具有抑菌、消炎、抗病毒等功能，可廣泛應用于醫藥制劑、食品防腐和生物工程領域。對溶菌酶的性質和應用進行了闡述，介紹了蛋清溶菌酶分離提取方法，為進一步開發利用蛋清溶菌酶資源提供了科學依據。

蛋殼；蛋清；溶菌酶

0 引言

溶菌酶又稱胞壁質酶，或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種能水解致病菌的糖苷水解酶，其酶解主要作用于微生物細胞壁，而不影響其他組織。因此，也是一種安全無毒的蛋白質。溶菌酶廣泛存在于鳥類和家禽的蛋清中，哺乳動物的乳汁、唾液、血液、尿液、白細胞及其他體液和組織細胞內，其中以鳥類和家禽蛋清中溶菌酶含量最為豐富，為0.2%～0.4%[1]。目前，市面上銷售的多數商品溶菌酶就是從蛋清中提取純化的。

我國是傳統的禽蛋生產大國，擁有極為豐富的禽蛋資源。據國家統計局公布的統計資料數據顯示，2016年我國禽蛋產量已突破3 000×104t。蛋品加工企業和廣大消費者在利用禽蛋的時候往往都只取用了蛋黃、蛋清等可食部分，而蛋殼則被當作廢物扔棄，造成了環境污染，這些蛋殼中殘留了大量的蛋清，占蛋殼質量的27.6%～30.8%[2]。由此可見，如果不對蛋殼及時處理，既嚴重污染生態環境，又造成蛋清資源的浪費。

1 溶菌酶的性質與應用

早在1907年，Nicolle發現在枯草芽孢桿菌的溶液中存在一種未知的溶解子，這是人類第1次接觸溶菌酶這種物質。1922年，Fleming等人發現在人的眼淚、唾液中存在能夠溶解細菌細胞壁進而殺死細菌的酶，并命名為溶菌酶。商品溶菌酶一般為白色或微白色粉末狀物質，易溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI值為11.00～11.35，最適pH值為6.5。其在酸性介質中可穩定存在，而在堿性介質中易失活。

溶菌酶能夠水解細胞壁肽聚糖結構中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵[3]，因此可以溶解大多數革蘭氏陽性菌的細胞壁而具有溶菌作用，其對一些革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌和傷寒沙門氏菌）也具有較強的溶解作用。由此可見，溶菌酶的抗菌譜較廣。同時，溶菌酶作為一種天然蛋白質，對人體無毒害作用，具有抑菌、消炎、抗病毒等功能，能在胃腸內起到幫助消化、吸收的作用，并能提高機體免疫力，是一種安全性較高的食品保鮮劑、營養保健品和抗菌消炎類藥品。同時，由于其在弱酸性環境下也能保持較強的活力，因此可作為防腐劑應用于低酸食品中。另外，還是基因工程、細胞工程中細胞融合操作必不可少的工具酶[4]，用來提取微生物細胞內各類物質，以及進行原生質體制備及融合育種。

2 蛋殼殘留蛋清溶菌酶的提取方法

目前，國內外從蛋殼殘留蛋清中提取溶菌酶時，將收集的蛋殼利用蛋殼處理機使蛋殼與殘留蛋清分離、過濾，然后采用直接結晶法、離子交換法、親和色譜法和超濾法等方法，從蛋清中分離提取溶菌酶。

2.1 直接結晶法

溶菌酶是一種較為穩定的蛋白質，具有較強的耐熱、耐酸特性，在鹽溶液中也具有較好的穩定性，通過改變環境pH值，可以使其以晶體形式析出，從而可以利用這一特性將溶菌酶與蛋清進行分離。1945年Alderton G等人[5]提出采用直接結晶法制備溶菌酶，通過向蛋清中加入一定量的氯化物、碘化物或碳酸鹽等中性鹽，并使用氫氧化鈉調節溶液pH值至9.5～10.0，再逐步降低反應體系溫度至4℃，放置2周時間，溶菌酶就會以結晶形式慢慢析出，而大多數蛋白質仍然存留在溶液中，從而將溶菌酶從蛋清中分離出來。但是，采用直接結晶法分離出來的溶菌酶純度較低，因此需要采用重結晶的方法對分離出的溶菌酶初品進行提純。采用直接結晶法分離提取溶菌酶具有操作簡單、設備要求低、反應條件溫和、成本低等優點，是目前以蛋清為原料分離提取溶菌酶的主要方法。

2.2 離子交換法

離子交換法是利用離子交換劑與溶液中的離子之間所發生的交換反應進行物質分離的操作技術。2001年，李宗孝等人[6]采用724型樹脂提取雞蛋清溶菌酶，攪拌吸附后用1%的硫酸溶液洗脫，溶菌酶得率為0.14%。2002年，林親錄等人[7]采用732型樹脂純化溶菌酶，研究了不同pH值對溶菌酶提取效果的影響。2003年，宋宏新等人[8]采用724型樹脂提取溶菌酶，裝柱后抽提液緩慢流入柱中，先用緩沖液洗滌，再用硫酸銨洗脫，使得724型樹脂對溶菌酶的吸附率提高到83.5%。2007年，Bayramoglu G等人[9]用反相懸浮法制備了聚甲基丙烯酸接枝殼聚糖陽離子交換色譜填料來分離蛋清中的溶菌酶，并探索了樹脂吸附溶菌酶過程的動力學模型，用HPLC測定洗脫液中溶菌酶的純度達到94%。采用離子交換法分離提取溶菌酶具有操作簡便、高效、成本低和可自動化連續生產等優點，適用于溶菌酶的工業化生產。

2.3 親和色譜法

20世紀80年代末發展起來的親和色譜技術是利用物質的親和能力，將不溶性的載體與可逆結合的配體相偶聯，所制成的分離介質具有特異親和性，能選擇性地吸附生物活性物質，根據待分離物質的特性，選擇相應組成的溶液進行洗脫，從而達到分離提取所需物質的目的。2001年，Vaidya A A等人[10]采用酸單體與N-異聚丙烯酰胺共聚物從蛋清中熱沉淀溶菌酶，收率達到90%。2007年，Lu A X等人[11]制備了一種新型的固定化Fe3+膠原纖維基質吸附劑，用這種吸附劑對溶菌酶進行吸附研究，得到溶菌酶純度達到100%。采用親和色譜法分離提取溶菌酶具有快速、高效等優點，能對蛋殼殘留蛋清中的溶菌酶進行高效分離與純化。

2.4 超濾法

超濾法是通過控制超濾膜孔徑大小，在壓力的作用下將不同分子量的混合物溶液進行分離，從而獲得目標產物。超濾法是一種對新型的分離技術，其與傳統分離技術相比具有產品得率高、雜質少、純度高等優點。蛋清中含有卵白蛋白、卵鐵傳遞蛋白、卵黏蛋白、卵類黏蛋白和卵球蛋白等幾種主要蛋白質，與其相比溶菌酶的分子量遠小于上述蛋清中幾種主要蛋白質的分子量，因此可用超濾法將溶菌酶從蛋清蛋白中分離出來。2000年，Ghosh R等人[12]采用小型中空纖維超濾系統從蛋清干粉中分離溶菌酶，溶菌酶選擇性透過膜，而其他大分子蛋白質被膜所截留。

3 結語

溶菌酶是一種天然、安全無毒的蛋白質，具有廣闊的應用前景。利用蛋殼中的殘留蛋清來分離提取溶菌酶，既解決了蛋殼中殘留蛋清污染環境的問題，又充分挖掘了殘留蛋清潛在的利用價值，有效降低了雞蛋溶菌酶的生產成本。上述幾種分離方法雖各具優點，但仍然存在一些不足之處。因此，要不斷拓寬研究思路，優化現有分離提取工藝，積極探索新的分離提取方法。

[1]左勝，吳佳歡，廖志勇.蛋清溶菌酶分離純化研究進展 [J].科協論壇（下半月），2013（3）：73-74.

[2]杜利成.試論雞蛋殼及其綜合利用 [J].四川食品與發酵，2000（4）：10-13.

[3]林翠花，肖素榮，孟慶國.溶菌酶結構特點及其應用[J].濰坊學院學報，2005（2）：108-110.

[4]史小利，李宗謙，徐淑霞，等.蛋清溶菌酶提取工藝研究 [J].現代農業科技，2008（6）：166-168.

[5]Alderton G，Ward W H，Fevold H L.Isolation of lysozyme from egg white[J].Bio.I Chem，1945（1）：43-58.

[6]李宗孝，原春蘭，張建超.蛋清中溶菌酶的提純研究[J].精細化工，2001，18（2）：103-105.

[7]林親錄，馬美湖，金陽海，等.雞蛋卵清中溶菌酶的提取與純化 [J].食品科學，2002，23（2）：43-45.

[8]宋宏新，薛海燕，楊芳.雞蛋殼溶菌酶分離純化工藝研究 [J].食品工業科技，2003（9）：60-63.

[9]Bayramoglu G，Ekici G，Besirli N，et al.Preparation of ion-exchange beads on poly(methacylic acid）brush grafted chitosan beads：Isolation of lysozyme from egg white in batch system[J].Colloids and Surfaces A，2007（5）：68-77.

[10]Vaidya A A，Lele B S，Deshmukh M V，et al.Design and evaluation of new ligands for lysozyme recovery by affinity thermoprecipitation[J].Chemical Engineering Science，2001（7）：5 681-5 692.

[11]Lu A X，Liao X P，Zhou R Q，et al.Preparation of Fe3+-immobilized collagen fiber for lysozyme adsorption[J].Colloids and Surfaces A，2007（2）：85-93.

[12]Ghosh R，Silva S S，Cui Z F.Lysozyme separation by hollow-fiber ultrafiltration[J].Biochemical Engineering Journal，2000 （6）：19-24.◇

Study on the Efficient Extraction of Lysozyme from Egg White

LI Fengzhen
（College of Bioengineering，Hu'nan Environment Biological Polytechnic，Hengyang，Hu'nan 421005，China）

The residual eggshell quality accounts for 27.6%～30.8%of egg white，egg white lysozyme containing 0.2%～0.4%.The process can be obtained through separation of lysozyme from egg white lysozyme.A series of extraction is a kind of natural protein，it has no toxic effects on the human body，and has antibacterial，anti-inflammatory，anti viral and other functions，can be widely used in the field of pharmaceutical preparation the preservation of food and biological engineering.In this paper，the properties and applications of lysozyme were described，introduced the lysozyme extraction method provides a scientific basis for further development and utilization of lysozyme resources.

eggshell；egg white；lysozyme

Q956

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.043

1671-9646（2017） 12b-0057-02

2017-09-29

湖南環境生物職業技術學院院長青年基金項目（Z2013-1）。

李逢振（1983— ），男，碩士，副教授，研究方向為畜產品加工和畜禽廢棄物綜合利用。