磁探針對兔脂肪干細胞的生長影響及T2*mapping成像

謝光友，耿濤，楊海濤，呂富榮，曾憲春，劉昌杰，楊明放，王榮品

2001年Zuk等[1]首次從人抽脂術中分離培養出ADSCs，相繼證實ADSCs具有向多胚層多功能細胞的分化潛能。磁探針SPIO-PLL制作簡單、易于排泄，MR成像無創且分辨率高，已成為示蹤移植干細胞的理想無創方法。本研究通過流式細胞技術分析不同濃度磁探針對ADSCs生長的影響，尋找安全標記濃度，并行體外定量MR成像，為活體示蹤移植磁標記細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Annexin-v-FITC細胞凋亡及周期檢測試劑盒(Becton Dickinson公司)，倒置相差熒光顯微鏡(NIKON TE2000-U)，透射電子顯微鏡(日本HITACHI-7500型)，流式細胞儀(美國BD公司)，GE HD-X signa 3.0 T MRI成像系統(美國GE公司)、腕關節線圈等。ADSCs的培養鑒定、磁探針及Perls反應液的制作見文獻[2]。

1.2 普魯士藍染色

取12孔板，每孔加入單細胞懸液1 ml (1×105個)，培養過夜后分別加25、50、75 μg/ml的磁探針培養液1 ml，未加探針組為空白對照組，各設3個復孔。孵育過夜后棄上清，PBS漂洗、4%多聚甲醛固定40 min，雙蒸水洗滌、Perls反應液作用30 min、棄反應液、雙蒸水洗滌、核固紅復染5 min、PBS洗滌、晾干、二甲苯透明處理10 min后中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.3 透射電鏡鑒定

收集各濃度組單細胞懸液1×106個，1200 r/min離心5 min后棄上清，沿管壁緩慢加入2.5%的戊二醛溶液4 ℃固定1 h，PBS洗滌，1%四氧化鋨4 ℃固定h，PBS洗滌，梯度丙酮脫水，0.5%醋酸鈾4 ℃染色固定過夜，環氧樹脂包埋，切片，透射電鏡觀察。

1.4 流式檢測細胞凋亡

收集各濃度組及對照組細胞各1 ml (1×106個)，離心后PBS洗滌，將細胞重懸浮于200 ml結合緩沖液，加10 ml Annexin-v-FITC，室溫避光放置10 min，再加5 μl碘化丙啶(PI)，混勻后室溫避光放置15 min，PBS洗滌，加300 μl結合緩沖液重懸細胞后上機檢測。細胞凋亡圖左下象限An (-) PI (-)，右下象限An (+) PI (-)，右上象限An(+) PI (+)，左上象限An (-) PI (+)分別代表正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡及壞死細胞及收集過程中的損傷細胞。

1.5 流式分析細胞周期

收集各濃度組及對照組細胞各1 ml (1×106個)，離心PBS洗滌，70%乙醇固定，4 ℃放置過夜，PBS洗滌，加20 mg/ml核糖核酸酶A(RNaseA)，37 ℃水浴1 h后加100 mg/l PI，4 ℃避光染色30 min，行流式細胞儀490 nm處檢測并行細胞周期DNA含量分析。

1.6 定量MR成像

收集經25μg/ml磁探針標記的細胞 5×105個(1 d)、1×106個(1 d)、1×106個(3 d)及1×106個(未標記)，轉入裝有1%瓊脂糖溶液的EP管中振蕩混勻，置入腕關節線圈內，行GE HD-X signa 3.0 T GRE T2*WI及多回波T2*mapping序列掃描，通過adw 4.6工作站的Functool軟件包中的T2*弛豫時間測量軟件，選取ROI測量各組T2*弛豫時間。T2*WI成像參數：TR 250 ms，TE 12 ms，FOV 8 cm×8 cm，層厚2 mm，層間距0.5 mm，NEX為3，矩陣324×256，反轉角20°。T2*mapping成像參數：TR 1000 ms，TE 11.1、22.2、33.3、44.4、55.5、66.6、77.7、88 ms，FOV 8 cm×8 cm，層厚2 mm，層間距0 mm，矩陣320×224。

1.7 統計分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，實驗數據用表示，多組間比較用單因素方差分析方法，兩兩間比較應用LSD-t方法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 普魯士藍染色及電鏡

光鏡下示磁標記細胞普魯士藍陽性染色率近100%，胞漿內見藍色致密顆粒，數量不等(圖1A)。透射電鏡示磁標記細胞漿內見斑點狀的高密度氧化鐵顆粒，聚集在胞漿的囊泡內(圖1B)。

圖1 A：磁標記細胞普魯士藍染色( ×400)胞漿內見藍色鐵顆粒(白箭)；B：磁標記細胞透射電鏡觀察( ×15000)胞漿囊泡見致密鐵顆粒(白箭) 圖2 Annexin/PI雙染色法檢測細胞凋亡。A～D分別為對照組、25、50、75 μg/ml磁探針標記細胞組 圖3 GRE T2*WI序列軸面成像。1～6組分別為蒸餾水、瓊脂、1×106個細胞(未標記)、5×105個細胞(1 d)、1×106個細胞(3 d)、1×106個細胞(1 d)，第6組信號強度最低Fig. 1 A: The labelled cells Prussian blue staining ( ×400) Blue particles were observed in nearly every cytoplasm (white arrow). B: The labelled cells observed under TEM ( ×15000). The dense particles were observed in cytoplasmic vacuoles (white arrow). Fig. 2 The cell apoptosis rate detected through Annexin/PI double staining method. A—D respresented blank group, ADSCs labelled with 25, 50, 75 μg/ml SPIO-PLL respectively. Fig. 3 The axial image of GRE T2*WI sequences. 1—6 groups represented distilled water, agar, 1×106 cells (unlabeled), 5×106 (labeled 1 d), 1×106 (labeled 3 d) and 1×106 cells (labeled 1 d), respectively, the SI of the sixth group was the lowest.

表1 SPIO-PLL對細胞周期與凋亡的影響(n=3，%，Tab.1 Effects of SPIO-PLL on ADSCs cell cycle progression and apoptosis(n=3, %

表1 SPIO-PLL對細胞周期與凋亡的影響(n=3，%，Tab.1 Effects of SPIO-PLL on ADSCs cell cycle progression and apoptosis(n=3, %

注：a，與空白對照組比較，P＜0.01

分組 G0/G1 細胞周期S G2/M 凋亡率空白對照組25μg/ml組50μg/ml組75μg/ml組9.939 0.004 70.73±1.40 72.34±3.71 82.70±1.95a 83.89±2.66a 12.83±0.29 12.47±1.76 7.45±1.51a 7.13±2.70a 16.44±1.43 15.19±2.30 9.85±0.56a 8.98±1.28a 8.73±1.94 12.92±4.87 20.49±3.53a 22.41±3.12a F值P值21.099 0.000 9.040 0.006 18.190 0.001

2.2 對細胞周期和凋亡的影響

經25、50、75 μg/ml磁探針標記細胞后，流式細胞儀檢測各組細胞周期，50、75 μg/ml組G0/G1阻滯率較空白對照組明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)，而25 μg/ml組與空白對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。運用Annexin/PI雙染色，流式細胞儀檢測各組間凋亡率具有統計學差異(P＜0.05)，其中25 μg/ml組與對照組間比較無明顯差異(P＞0.05)，為安全標記濃度(圖2，表1)。

2.3 MR成像

收集的各組細胞置入腕關節線圈內，行GE HD-X signa 3.0 T MRI掃描，GRE T2*WI序列掃描顯示經25 μg/ml磁探針標記1×106個(1 d)的信號強度最低(圖3)；經多回波T2*mapping序列掃描后，測量1～6組T2*弛豫時間分別為(17.30±0.44) ms、(17.27±0.55) ms、(16.63±0.86) ms、(10.10±0.40) ms、(10.17±0.31) ms、(9.33±0.42) ms，對照組與各磁標記細胞組T2*弛豫時間比較，差異均有統計學意義(F=169.837，P＜0.01)。

3 討論

2001年Zuk首次從抽脂術中分離培養出ADSCs，2004年ADSCs首次被移植治療一位顱面部嚴重損傷的患兒，并取得了滿意的療效[3]。目前ADSCs作為一種多功能的成體干細胞，已經實現自體、異體及異種移植，相繼被移植用于治療外周神經及肌腱韌帶損傷、椎間盤退變、克羅恩病以及抑制排斥反應等[4-7]。本研究聯合應用轉染劑PLL與SPIO制成理化性質穩定的SPIO-PLL懸液，具有正電效應，能與帶負電的細胞膜高親和力結合形成囊泡內吞進入細胞，同時又有明顯的負性效應[8]；本研究結果證實普魯士藍染色及透射電鏡示ADSCs磁標記率近100%，鐵顆粒以囊泡的形式內吞入細胞漿。納米鐵生物降解性強，能夠通過旁路代謝進入血漿鐵池并參與鐵的循環代謝，因此SPIO-PLL是一種理想的MR活體示蹤劑，可安全高效標記不同物種的多種細胞[9-12]。

細胞凋亡不同于細胞死亡，前者是一種由基因調控的主動程序性死亡過程，檢測凋亡的方法及特點：(1)顯微鏡只局限于觀察細胞的形態；(2)電泳法不能清晰顯示細胞的內部結構；(3)免疫學法不能實現細胞的準確定位；(4)原位缺口末端標記法(TUNEL法)難以控制處理時間；(5)流式法，聯合應用熒光探針Annexin-v-FITC與核酸染料PI能區分凋亡細胞與壞死細胞。細胞凋亡過程中，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸外露早于細胞的DNA，Annexin-V能與膜外的磷脂酰絲氨酸特異性結合，因此流式法能更敏感地檢測早期凋亡細胞；同時，流式法不需要固定細胞，避免因細胞固定過程中造成的細胞碎片過多及原位缺口末端標記法因固定出現的DNA片段丟失，因此流式法檢測細胞凋亡更省時、結果更可靠，是最佳的凋亡定量檢測方法[13-15]。

細胞周期包括分裂間期和有絲分裂期(M期)，分裂間期又分為生長前期(G1期)，DNA合成期(S期)及生長后期(G2期)，各時期細胞的DNA含量均不同，與核酸染料PI結合后顯示的熒光強度不等，因此流式細胞儀可敏感檢測細胞的生長情況[16-17]。本研究表明隨著磁探針濃度增大，ADSCs的早晚期細胞凋亡率及壞死率增大，細胞周期阻滯率增高，以G0/G1期明顯，其中25μg/ml組細胞周期阻滯率及凋亡率與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)，對細胞分裂增殖及凋亡無明顯影響，因此25μg/ml磁探針為有效安全標記濃度。

本研究用磁探針標記1×106、5×105個細胞1 d，1×106個細胞標記1 d、3 d，后者弛豫時間均較前者短，這可能與細胞數量增多、培養時間延長，細胞增殖分化能力及生物降解能力降低有關；用25μg/ml磁探針標記1×106個細胞1 d后，T2*弛豫時間最短，有明顯統計學意義(P＜0.01)，為下一步活體移植經25μg/ml的磁探針標記細胞，并運用T2*mapping技術定量評價移植細胞生長情況奠定基礎。雖然死亡細胞釋放出鐵粒子或巨噬細胞吞噬磁標記細胞使周圍細胞或組織呈假陽性，干擾對移植細胞生長狀況的精準靶向示蹤，但隨著示蹤技術的不斷改進，MRI在干細胞移植及示蹤領域會有光明的應用前景。

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