磁共振擴散峰度成像評價宮頸癌放療后變化的小鼠實驗研究

曹崑，王帥，趙博，李曉婷，唐磊，孫應實

宮頸癌是最常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，尤其在發展中國家發病率較高，且通常發病時分期較晚，已不能進行手術，故放療是我國宮頸癌治療的最主要方式。對放療效果的評價方法中，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)是公認的客觀、準確性高的影像學方法，尤其磁共振擴散加權成像(diffusion-weighted imaging，DWI)，因為能夠無創地在體量化組織水分子擴散情況，已經在很多機構成為常規的宮頸癌檢查序列，不僅能夠幫助提高癌灶的檢出，還可以進行腫瘤治療的監測和效果預測評價[1-3]。但限于DWI的量化值表觀擴散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)僅采用標準的單指數模型、遵循高斯分布進行計算，數值單一，應用有限度，后出現了很多其他數學模型對DWI進行優化，從不同方面量化微觀結構的擴散信息。其中基于非高斯算法的擴散峰度成像(diffusion kurtosis imaging，DKI)已成為研究熱點，被認為能夠反映更為復雜的組織微結構情況，在很多疾病中被證明DKI比常規模型更有價值，可以用于發現癌灶，如前列腺癌[4-5]、乳腺癌[6]，也與癌分化程度有一定相關[7]。但在宮頸癌中的研究較少，與治療的相關變化亦缺乏相關數據。本研究以宮頸癌小鼠動物模型為研究對象，著重探討DKI相關的衍生參數因腫瘤放射治療所產生的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗通過了北京大學腫瘤醫院醫學研究倫理委員會的批準，遵循動物實驗倫理原則。11只4～6周齡BALB/C-nu/nu 雌性裸鼠，體重100～150 g，飼養于SPF級(無特定病原微生物)動物實驗室內。 人宮頸癌HELA細胞常規復蘇后傳代培養，取對數生長期的細胞制備細胞濃度約4×107/ml～5×107/ml的細胞懸液，接種于小鼠通過左側腋下及右側腹股溝區大腿皮下組織內以制作移植瘤模型，每日觀察局部腫瘤生長情況。接種后6～8 d，于注射部位出現明顯質地較硬的結節，有1只小鼠腋下未成瘤、1只小鼠此期間不明原因死亡。成瘤率約88%。其余11只小鼠繼續觀察3周左右，局部腫瘤大小約1 cm左右，開始進行磁共振成像檢查(放療前)。然后對所有小鼠腹股溝區腫瘤進行一次性大劑量放療照射(15 Gy)，照射后1周時(放療后)再行磁共振檢查。將腋下腫瘤作為未接受放射治療的對照組。11只小鼠完成本實驗后全部處死取腫瘤做病理切片，無因放療所致死。

1.2 MRI檢查方法

所有小鼠逐一行MRI檢查。采用1.5 T磁共振掃描儀(Aera, Siemens)，自制實驗動物專用相控陣線圈。常規禁飲食2 h，掃描前腹腔注射異戊巴比妥鈉麻醉(濃度0.8%，劑量50 mg/kg)。掃描取頭先進、仰臥位。

(1)常規序列：軸位T2WI ，TR 3500.0 ms，TE 87.0 ms，帶寬130.0 Hz，FOV 6.4×6.4 cm，層厚2.0 mm，層間距0.2 mm，矩陣192×192，掃描時間2 min 44 s。(2)多b值DWI序列：采用單次激發自旋回波擴散加權平面回波成像(single short echo planar imaging，ss-EPI)序列，選取b值11個，分別為0、50、100、200、400、600、800、1000、1200、1600、2000 s/mm2軸面，TR 3200.0 ms，TE 58.0 ms，帶寬715.0 Hz，FOV 7.6 cm×7.6 cm，層厚2.0 mm，層間距0.2 mm，矩陣76×76，激勵次數均為2，掃描時間 13 min 6 s。中心線及所有層面定位拷貝T2WI圖像。

圖1 所獲各序列圖像及參數圖上感興趣區勾畫示例。以小鼠左側腹股溝區腫瘤最大層面為例，以T2WI (A)為參照，定位腫瘤(白箭)位置及層面，在b=2000 s/mm2的圖像上(B)沿病變邊緣勾畫感興趣區，復制到ADC圖(C)、MK圖(D)及其他參數圖上用以獲取數值 圖2 腹股溝區腫瘤放療前后的平均MK值變化箱式圖。放療前平均MK值1.14±0.12，放療后明顯降低至1.02±0.10，配對t檢驗差異有統計學意義(P=0.003) 圖3 腹股溝區腫瘤放療前后的平均ADC值變化箱式圖。放療前平均ADC值0.571±0.063×10-3 mm2/s，放療后明顯升高至0.611±0.055×10-3 mm2/s，配對t檢驗差異有統計學意義(P=0.015) 圖4 未放療和經放療的腫瘤MR與病理切片對照。圖A～C示未放療的右腋下腫瘤(A：MR T2WI，B：MR DWI)，病理切片HE染色10倍放大圖(C)可見大量活躍生長的癌細胞聚集。圖D～F示經放療后的左腹股溝區腫瘤(D：MR T2WI；E：MR DWI)，病理圖片(F)可見瘤床癌細胞出現變性反應，包括細胞收縮、核固縮、核碎裂及空泡化(HE ×10)Fig. 1 The way to draw regions of interest on images for all sequences and parametric maps. Taking the tumor on left inguinal area of one mouse as an example. T2WI (A) is used as a reference to locate tumor (white arrow) and to select slice. ROI is drawn along the rim of the tumor on b=2000 s/mm2 images(B), and is copied to ADC map (C), MK map (D) and other parametric maps to acquire the values. Fig. 2 Boxplot showing changes of MKav of the tumors in inguinal areas before and after radiation. MKav decreased from 1.14±0.12 (before radiation) to 1.02±0.10 (after radiation) with statistical significance(pair sample t-test, P=0.003). Fig. 3 Boxplot showing changes of ADCav of the tumors in inguinal areas before and after radiation. ADCav increased from 0.571±0.063×10-3 mm2/s (before radiation) to 0.611±0.055×10-3 mm2/s (after radiation) with statistical significance (pair sample t-test, P=0.015).Fig. 4 Comparison of MR images and pathological section for tumors without and with radiation. MR images (A: T2WI. B: DWI) of a tumor without radiation. The pathological section with hematoxylin-eosin staining (C) shows abundant tumor cells with high proliferative activities. MR images (D:T2WI. E: DWI) of a tumor after radiation. The pathological section (F) shows the degeneration and shrinkage of tumor cells, in which nuclear pyknosis,karyorrhexis and vacuolization can be found, indicating the reactions because of radiation (HE ×10).

1.3 圖像分析及數據采集

所有圖像傳至后處理工作站進行圖像質量觀察以及前后兩次檢查圖像對比以幫助進行病灶相應層面定位。多b值DWI序列在SIEMENS syngo工作站自動生成ADC圖，并傳至第三方軟件(DKI-tool，Matlab平臺上開發)生成DKI模型相關參數圖，包括平均擴散率(mean diffusivity，MD)和平均擴散峰度值(mean diffusion kurtosis，MK)，計算公式如下 ：

式中S是特定b值下的DWI信號強度，S0是無擴散加權時的基線信號強度，D是擴散率，K是峰度值。

感興趣區(region of interest，ROI)勾畫方法(圖1)：以T2WI圖像為參照，選取病灶所有層面，在DWI序列的b=2000 s/mm2圖像上沿病變邊緣手動勾畫感興趣區，得到全病灶數值。所獲參數值包括：腫瘤體積、平均(av)及中位(m) MD、MK、ADC值(此ADC值為多b值加權的混合值)。

1.4 統計方法

采用SPSS 18.0軟件對各項參數進行統計學分析。經K-S擬合優度檢驗，所有參數數據符合正態分布。故采用Pearson相關性檢驗對MK、MD、ADC值進行相關性分析，采用配對t檢驗對比同一組腫瘤治療前后的參數變化。P≤0.05為差異有統計學意義。

表1 MK、MD、ADC值之間的相關性分析Tab. 1 Correlation analysis between MK, MD and ADC values

表2 放療前后MK、MD及ADC各值變化情況Tab. 2 Changes of MK, MD and ADC values before and after radiation

表2 放療前后MK、MD及ADC各值變化情況Tab. 2 Changes of MK, MD and ADC values before and after radiation

注：配對t檢驗。aP＜0.05

參數 治療前 治療后 t值 P值MKav 1.14±0.12 1.02±0.10 3.928 0.003a MKm 1.13±0.10 1.14±0.10 3.804 0.003a MDav (×10-3 mm2/s) 0.856±0.105 0.885±0.071 -1.230 0.247 MDm (×10-3 mm2/s) 0.843±0.113 0.878±0.081 -1.493 0.166 ADCav (×10-3 mm2/s) 0.571±0.063 0.611±0.055 -2.926 0.015a ADCm (×10-3 mm2/s) 0.543±0.052 0.587±0.041 -3.026 0.013a

表3 對照組腫瘤前后兩次檢查的MK、MD及ADC各值變化情況Tab. 3 Changes of MK, MD and ADC values in tumors of contrast group

表3 對照組腫瘤前后兩次檢查的MK、MD及ADC各值變化情況Tab. 3 Changes of MK, MD and ADC values in tumors of contrast group

注：配對t檢驗

參數 治療前 治療后 t值 P值MKav 1.12±0.10 1.15±0.10 -0.623 ＞0.05 MKm 1.13±0.12 1.17±0.07 -0.842 ＞0.05 MDav (×10-3 mm2/s) 0.766±0.078 0.771±0.046 -0.155 ＞0.05 MDm (×10-3 mm2/s) 0.754±0.079 0.767±0.050 -0.399 ＞0.05 ADCav (×10-3 mm2/s) 0.557±0.051 0.547±0.025 0.610 ＞0.05 ADCm (×10-3 mm2/s) 0.540±0.050 0.525±0.024 0.822 ＞0.05

2 結果

共11只小鼠21個腫瘤(11個腹股溝區腫瘤，10個腋下腫瘤)完成實驗，其中1例腋下腫瘤因療前掃描范圍不足剔除。

2.1 DKI衍生值與ADC值之間的相關性(表1)

共計21例腫瘤，將治療前ADC、MK、MD的中位值與平均值分別進行Pearson相關性檢驗，r＞0.9，說明存在強相關性。無論平均值還是中位值，ADC與MK之間存在負相關性(r＞0.7)；ADC與MD之間存在正相關性(r＞0.7)，而MK和MD之間僅中位值存在負相關性(r為-0.538)，平均值無相關性。

2.2 腹股溝區放療組腫瘤隨治療的參數值變化情況(表2)

腹股溝區11個腫瘤治療前長徑平均值8.29 mm(范圍6～11.5 mm)，治療后長徑平均值7.83 mm (范圍6.1～8.9 mm)。相對于治療前，放療后腫瘤的MK明顯降低(圖2)、ADC值明顯升高(圖3)，均具統計學顯著性差異(配對t檢驗，P＜0.05)。MK平均降低幅度約9.4%，ADC平均升高幅度約7.5%。MD有升高趨勢但未達統計學差異。病理切片HE(hematoxylin-eosin)染色可以看到經放療打擊后的瘤床癌細胞收縮、有核固縮、核碎裂及空泡化等變性表現，間質增加(圖4)。

2.3 腋下對照組腫瘤兩次MRI的參數值變化情況(表3)

對照組腋下10個腫瘤第一次檢查(腹股溝組的治療前時間點)長徑平均值10.61 mm (范圍8～12.8 mm)，第二次檢查(腹股溝組的治療后時間點)長徑平均值11.01 mm (范圍7.7～13.3 mm)。兩次檢查的MK、MD及ADC值差異均無統計學意義。病理切片可以看到大量生長活躍的癌細胞聚集、間質少(圖4)。

3 討論

既往多部位的腫瘤研究已經證實，由于癌細胞分布相對密集、微環境復雜，水分子擴散受限程度普遍明顯高于正常組織，ADC值較低，與宮頸癌結果相似[8-10]，且ADC值與無病生存率和復發等相關[2-3]。DKI模型是在DWI基礎上由Jenson等[11]在2005年提出的非高斯模型算法，在常規采用的組織受限程度測量基礎上提出了新的度量值“峰度”，用以描述組織微結構的復雜程度，要求盡可能使用超高b值的敏感梯度場。本研究中建立的宮頸癌小鼠模型擴散b值最高為2000 s/mm2，符合DKI的計算要求。

3.1 擴散峰度成像量化值與常規ADC值之間的相關性

本研究結果中，MD、MK、ADC各值的平均值與中位值之間均具強正相關性(r值均＞0.9)，符合正態分布的預期。本組數據中，ADC值與MD、MK之間分別具有強正相關和強負相關(r＞0.7)，也基本符合三者的理論預期關系。ADC值是采用高斯模型計算的混合值，受分子內水分子擴散情況以及細胞微環境的影響，而D亦為擴散相關值，是修正的ADC值，被認為比ADC值更能反應水分子的真實擴散受限情況，故兩者反映的是相似的內容，應當具有正向的強相關性。根據既往文獻提供的數據，MD值普遍高于ADC值[7，12]，與本組的數據情況相符。K作為一無量綱的數值，理論上反映的是真實水分子擴散位移與理想的非受限高斯分布擴散位移的偏離大小，越大則代表感興趣區內水分子真實擴散受限情況越顯著、細胞微環境越復雜(MK為各個方向的峰度系數平均值)，與ADC值的越低則說明水分子擴散受限顯著有相反趨勢，故存在負向的強相關性符合預期。

3.2 ADC值及擴散峰度成像量化值隨放療產生的變化

在體研究均顯示，宮頸癌經放療后ADC值會升高[13-14]，是由于腫瘤細胞壞死收縮、間質體積增大致水分子擴散增加。本研究中，荷瘤小鼠經一次大劑量放療后，腫瘤的ADC值確實出現明顯增高，與之相符的表現是MK明顯降低。因MK反映的是細胞微環境復雜程度，即不均質性，細胞微結構在惡性病變中更為復雜和不均質，活躍的細胞分裂和強增殖能力增加每個體素的細胞密度，然后影響水分子擴散，高級別的癌比低級別的K值高[7,15]，宮頸癌的低分化組MK低于中高分化組[16]。在治療后MK的明顯降低說明腫瘤細胞內部因放療引起微環境損傷，所代表的組織間質、細胞膜結構等產生破壞而使微環境復雜程度降低，即不均質性降低。此點從本研究所獲病理切片中獲得證實，未放療的癌組織中可見大量癌細胞密集，因增殖活躍，細胞擁擠，間質成分少，符合癌腫微環境復雜、細胞密度高的推論。而經放療后，放射線通過損傷細胞DNA而引起細胞凋亡[17]，病理切片中表現出典型的癌細胞皺縮、核固縮、核碎裂及空泡等退變表現，間質成分增加、細胞密度減低。上述表現符合MK降低的預期。雖然MK和ADC兩值都產生相應變化，但MK平均降低幅度(約9.4%)高于ADC的平均升高幅度(約7.5%)。在既往大多數研究中認為K值比ADC值更有意義，但亦有認為兩者作用相仿。

在DKI模型算法中獲得的擴散系數D 值在既往研究中與ADC值的趨勢基本相仿，例如在惡性腫瘤中明顯低于良性腫瘤、且與病理分化程度相關[7,18]，在一項前列腺癌的研究中甚至認為D用于反映病理特征方面比K和ADC值更好[19]。相關病理對照研究較少，僅有的關于前列腺癌的影像病理鏡下結構的對比研究結果認為，峰度值K反映腫瘤細胞結構不均質性的增加；擴散率D則反映正常前列腺組織均勻的小管間隙及細胞結構[20]。在本研究中，治療前后的MD值雖有一定升高趨勢但未達到統計學顯著性差異。考慮對治療的反映中，ADC作為混合值混雜了擴散率和峰度的影響因素，而可能其中起主要作用的還是峰度值，而單純擴散率因素相對小或無。另一原因考慮受本研究病例數所限而未能達到顯著性差異亦有可能。

綜上，作為DWI的衍生序列，DKI不僅具有方便、可以非侵襲性量化組織內水分子布朗運動程度的優勢，而且提供了更為多樣性的衍生值。宮頸癌放療后會引起ADC值的升高和MK的降低，其中MK的變化幅度較高，提示擴散峰度成像用于放療評價的可行性。由于小鼠腫瘤僅在皮下，和活體的宮頸癌位置不同，受體內其他影響因素較小，而且小鼠腫瘤體積小、本研究樣本量小，與人體的活體研究可能存在差異，仍然需要在體研究進一步驗證DKI在腫瘤治療中的價值。

志謝：西門子中國有限公司磁共振科研合作部嚴序博士

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