內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞FGF21及其受體表達(dá)的影響和機(jī)制研究*

梁平平，仲琳，龔磊，王佳慧，楊軍

（1.濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東煙臺(tái)264003；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院心內(nèi)科，山東煙臺(tái)264000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院生物芯片實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái)264000；4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái)264000）

論著

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞FGF21及其受體表達(dá)的影響和機(jī)制研究*

梁平平1，仲琳2，龔磊3，王佳慧4，楊軍2

（1.濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東煙臺(tái)264003；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院心內(nèi)科，山東煙臺(tái)264000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院生物芯片實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái)264000；4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái)264000）

目的探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）對(duì)心肌細(xì)胞成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（FGF21）及其主要受體表達(dá)的影響和機(jī)制。方法在大鼠H9c2心肌細(xì)胞中加入不同濃度的衣霉素（TM）（1、5、10、20和50μmol/L）復(fù)制ERS模型，利用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（C-caspase3、GRP78、Bax、Bcl-2）和PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路相關(guān)蛋白（p-PERK、p-eIF2α、ATF4），CHOP蛋白，F(xiàn)GF21及其主要受體（p-FGFR1和β-Klotho）的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，TM處理組誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞發(fā)生ERS，提高促凋亡蛋白C-caspase3、GRP78、Bax的表達(dá)，減少抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并以濃度依賴形式降低細(xì)胞的存活率。此外，當(dāng)TM濃度≤10μmol/L時(shí)，TM處理組可以部分激活PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路，誘導(dǎo)FGF21、p-FGFR1、β-Klotho的表達(dá)；當(dāng)TM濃度＞10 μmol/L時(shí)，TM處理組完全激活PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路，誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)，而FGF21、p-FGFR1及β-Klotho表達(dá)卻隨TM濃度的增加而逐漸降低。結(jié)論FGF21及其主要受體的表達(dá)與ERS程度有關(guān)，輕微的ERS（TM濃度≤10 μmol/L）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞FGF21及其受體的表達(dá)，而嚴(yán)重的ERS（TM濃度＞10μmol/L）則相對(duì)降低FGF21及其受體的表達(dá)，其機(jī)制可能與PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路在ERS中的調(diào)控有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21；心肌細(xì)胞

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF21）作為一個(gè)新穎的內(nèi)源性因子，主要參與糖脂代謝的調(diào)節(jié)[1]。FGF21在受體β-Klotho輔助下主要與活化的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1）結(jié)合，形成FGF21-FGFR1-β-Klotho復(fù)合物，激活下游信號(hào)分子[2]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21作為心臟疾病的生物標(biāo)志物，在心肌肥大、心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化及心肌缺血/再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷等心血管病理生理?xiàng)l件下，其分泌和表達(dá)水平明顯升高[3-5]。

未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中大量積聚，引起細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），從而啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，URP）[6]，其中蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）-真核生物起始因子2（eukaryotic initiation factor 2，eIF2）α亞基-轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）信號(hào)通路的激活是細(xì)胞發(fā)生ERS的特征表現(xiàn)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，ERS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致心血管疾病重要的病理生理機(jī)制之一[8]，然而，F(xiàn)GF21及其主要受體的表達(dá)是否與ERS有關(guān)，尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同劑量的衣霉素（tunicamycin，TM）復(fù)制ERS模型，探索ERS對(duì)心肌細(xì)胞FGF21及其主要受體表達(dá)影響和可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠H9c2心肌細(xì)胞（上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），胎牛血清（fatal bovine serun，F(xiàn)BS）、達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential，DMEM）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)GF21抗體（英國(guó)Abcam公司），p-FGFR1抗體（Y654）（美國(guó)Immunoway公司），β-Klotho抗體（美國(guó)Sigma公司），F(xiàn)GFR1抗體、PERK抗體、p-PERK抗體、eIF2α抗體、p-eIF2α抗體、ATF4抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3剪切體（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，C-caspase-3）抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、Bcl-2的相關(guān)X蛋白（Bcl-2 assaciated X protein，Bax）抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）抗體、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）抗體、βactin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。本實(shí)驗(yàn)中除β-actin抗體抗性為小鼠抗兔，其他抗體抗性均為兔抗小鼠。二抗-羊抗兔IgG、二抗-羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、TM、總蛋白質(zhì)提取試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，活細(xì)胞計(jì)數(shù)法試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（日本Dojindo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模型的復(fù)制用含10％ FBS的高糖型DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞，常規(guī)置于37℃、5％二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將H9c2細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，TM于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中溶解，待細(xì)胞培養(yǎng)至80％融合時(shí)加入不同濃度的TM，至終濃度為1、5、10、20和50 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以含相同濃度的DMSO（0.5％）作為對(duì)照組。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率H9c2細(xì)胞以7× 103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至80％融合時(shí)，按1.2.1中的方法處理細(xì)胞，在各實(shí)驗(yàn)組中加入100 μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基及10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm處檢測(cè)光密度（optical density，OD）值，細(xì)胞存活率（％）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100％，每組設(shè)3孔，結(jié)果取均值，將所得比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 Western blot檢測(cè)收集各組細(xì)胞加入蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后切取目的蛋白，轉(zhuǎn)膜，用含5％牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗（FGF21 1︰500，F(xiàn)GFR1 1︰500，p-FGFR1 1︰200，β-Klotho 1︰500，C-caspase3 1︰300，GRP78 1︰500，Bax 1︰200，Bcl-2 1︰200，PERK 1︰1000，p-PERK 1︰1000，eIF2α 1︰1000，p-eIF2α 1︰1 000，ATF4 1︰500，CHOP 1︰500，β-actin 1︰1 000）4℃過(guò)夜，二氫甲基胺甲烷緩沖鹽溶液洗膜3次，加入對(duì)應(yīng)二抗（山羊抗小鼠1︰5 000，山羊抗兔1︰5 000）孵育1 h，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光并曝光成像，以β-actin作為對(duì)照，利用Image J軟件計(jì)算條帶灰度比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)≥3次，取各實(shí)驗(yàn)組平均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，在方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基礎(chǔ)上，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERS誘導(dǎo)凋亡蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)H9c2細(xì)胞凋亡

在TM誘導(dǎo)的ERS模型中，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，當(dāng)TM濃度≤10 μmol/L時(shí)，TM處理組以濃度依賴形式誘導(dǎo)ERS標(biāo)志蛋白C-caspase3、GRP78、Bax的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（F=105.489、63.048、25.127和63.443，P=0.000）；而當(dāng)TM濃度＞10 μmol/L時(shí)，C-caspase3、GRP78及Bax的表達(dá)水平最高并基本趨于平衡（見圖1A），提示過(guò)強(qiáng)的ERS（TM濃度＞10 μmol/L）以最大水平誘導(dǎo)凋亡蛋白大量合成。此外，隨著TM濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，并呈濃度依賴關(guān)系（見圖1B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 15.237，P=0.000），同時(shí)細(xì)胞形態(tài)也逐漸變得不規(guī)則，甚至死亡（見圖1C），提示ERS通過(guò)誘導(dǎo)凋亡蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡。

2.2 ERS激活PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路，誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)

檢測(cè)ERS特征性信號(hào)通路PERK-eIF2α-ATF4發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，當(dāng)TM濃度≤10 μmol/L時(shí)，p-PERK、p-eIF2α及ATF4的表達(dá)水平逐漸提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=94.910、60.676和80.397；P= 0.001、0.000和0.000），提示PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路部分被激活。而當(dāng)TM濃度＞10μmol/L時(shí)，p-PERK、p-eIF2α、ATF4表達(dá)水平最高并基本趨于平衡，提示PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路被完全激活。此外，CHOP作為PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路的下游分子，TM可誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)（F=60.721，P= 0.000），但當(dāng)TM濃度＞10μmol/L時(shí)，CHOP蛋白表達(dá)水平最高并保持平衡（見圖2），提示CHOP的表達(dá)量與PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路激活水平有關(guān)。

2.3 ERS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞FGF21及其主要受體的表達(dá)

與對(duì)照組比較，當(dāng)TM濃度≤10 μmol/L時(shí)，TM處理組以濃度依賴的形式誘導(dǎo)FGF21、p-FGFR1及β-Klotho表達(dá)，并在TM濃度為10μmol/L時(shí)達(dá)峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.674、17.863和37.336，P=0.000）；而在TM濃度＞10μmol/L時(shí)，F(xiàn)GF21及其主要受體的表達(dá)卻隨TM終濃度的增加而逐漸減少（見圖3），提示FGF21及其主要受體的表達(dá)與細(xì)胞ERS程度有關(guān)。

圖1 不同濃度TM中細(xì)胞凋亡蛋白和存活率的表達(dá)變化（n=3）

圖2 不同濃度TM對(duì)PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路和CHOP蛋白的影響（n=3）

圖3 不同濃度TM對(duì)FGF21及其主要受體的影響（n=3）

3 討論

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21作為心血管保護(hù)因子，具有改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，減輕心肌缺血性損傷等功能。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠心肌缺血時(shí)，可誘導(dǎo)肝臟合成和分泌FGF21，通過(guò)血循環(huán)到達(dá)受損心肌，減少心肌缺血性損傷[2]。此外，氧化型低密度脂蛋白以劑量依賴形式誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌和表達(dá)FGF21，而FGF21過(guò)表達(dá)則抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[9]。因此，F(xiàn)GF21反應(yīng)性升高可能是機(jī)體有效的代償反應(yīng)，從而減緩心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。

TM作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶抑制劑，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ERS。本研究利用不同濃度的TM復(fù)制H9c2細(xì)胞ERS模型，發(fā)現(xiàn)TM誘導(dǎo)促凋亡蛋白C-caspase3、GRP78、Bax的表達(dá)，減少抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞生存能力不斷降低和細(xì)胞功能、形態(tài)的改變，提示ERS通過(guò)誘導(dǎo)凋亡蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡。然而，隨著TM濃度增高（TM濃度＞10 μmol/L），ERS逐漸增強(qiáng)，誘導(dǎo)C-caspase3、GRP78、Bax表達(dá)水平也達(dá)到最高，細(xì)胞存活率降低，提示在TM濃度＞10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的ERS，從而誘導(dǎo)凋亡蛋白大量合成，加重細(xì)胞損傷。

在ERS早期，PERK-eIF2α-ATF4通路是URP最先啟動(dòng)的信號(hào)通路[7]，PERK誘導(dǎo)eIF2α磷酸化，激活A(yù)TF4，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶合成，從而減少未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的積累和聚集[6]，這也是機(jī)體自身代償?shù)谋憩F(xiàn)。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TM濃度≤10 μmol/L時(shí)，ERS誘導(dǎo)PERK和eIF2α發(fā)生磷酸化，以及增加ATF4的表達(dá)，從而部分激活PERK-eIFα-ATF4信號(hào)通路；而且FGF21及其主要受體p-FGFR1和β-Klotho也在ERS誘導(dǎo)下表達(dá)增加，并在TM濃度為10μmol/L時(shí)達(dá)高峰。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21啟動(dòng)子區(qū)包含ATF4結(jié)合位點(diǎn)[10]，ATF4過(guò)表達(dá)明顯誘導(dǎo)β-Klotho的合成[11]，提示ATF4可調(diào)控FGF21、β-Klotho的表達(dá)。因此，當(dāng)發(fā)生輕微的ERS時(shí)（TM濃度≤10 μmol/L），心肌細(xì)胞可能經(jīng)過(guò)PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)途徑代償性誘導(dǎo)FGF21及其主要受體的表達(dá)，從而形成更多的FGF21/FGFR1/β-Klotho復(fù)合物，減輕ERS對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。然而，隨著TM濃度的增加（TM濃度＞10 μmol/L），嚴(yán)重的ERS誘導(dǎo)p-PERK、p-eIF2α和ATF4表達(dá)水平達(dá)到最大，PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路完全被激活，F(xiàn)GF21、p-FGFR1和β-Klotho的表達(dá)水平反而逐漸降低，而ATF4的下游信分子CHOP卻經(jīng)PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路被大量誘導(dǎo)合成。研究發(fā)現(xiàn)，CHOP和FGF21均為ATF4的調(diào)控基因[7，10]，CHOP被大量合成，競(jìng)爭(zhēng)抑制FGF21及其主要受體的相對(duì)表達(dá)。因此，當(dāng)TM濃度＞10 μmol/L時(shí)FGF21及其主要受體的表達(dá)降低。此外CHOP作為ERS執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵蛋白[12]，其介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路成為嚴(yán)重的ERS誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要途徑，因此，在TM濃度＞10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降低。

綜上可知，輕微的ERS（TM濃度≤10 μmol/L）通過(guò)PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路代償性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞FGF21及其主要受體的表達(dá)，從而減輕心肌細(xì)胞損傷；而嚴(yán)重的ERS（TM濃度＞10 μmol/L）超過(guò)細(xì)胞自身代償能力，顯著激活PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路，CHOP蛋白的大量合成，競(jìng)爭(zhēng)抑制FGF21及其主要受體的相對(duì)表達(dá)。因此，F(xiàn)GF21及其主要受體的表達(dá)水平可能與不同程度ERS調(diào)控PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路的傳導(dǎo)有關(guān)，但其更進(jìn)一步的信號(hào)機(jī)制還需深入研究。

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（童穎丹 編輯）

Effect of endoplasmic reticulum stress on expressions of FGF21 and its receptors in cardiomyocytes and its mechanism*

Ping-ping Liang1,Lin Zhong2,Lei Gong3,Jia-hui Wang4,Jun Yang2
(1.Clinical Medical College,Binzhou Medical University,Yantai,Shandong 264003,China; 2.Department of Cardiology,3.Biochip Laboratory,4.Central Laboratory,the Affiliated Yuhuangding Hospital of Yantai,Medical College of Qingdao University, Yantai,Shandong 264000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of endoplasmic reticulum stress(ERS)on the expressions of fibroblast growth factor 21(FGF21)and its main receptors in cardiomyocytes and its mechanism.MethodsERS model was established by treating rat H9c2 cardiomyocytes with various concentrations of Tunicamycin (TM)(1,5,10,20 and 50 μmol/L).The cell survival rate was measured by CCK-8 assay.The expression of apoptosis-related proteins(c-caspase3,GRP78,Bax and Bcl-2),the key proteins of PERK-eIF2α-ATF4 signaling pathway(p-PERK,p-eIF2α and ATF4),CHOP as well as FGF21 and its main receptors(p-FGFR1 and β-Klotho)were measured by Western blot.ResultsCompared with the control group,TM treatment in－duced ERS in H9c2 cells,up-regulated the expression of pro-apoptosis proteins including c-caspase3,GRP78 and Bax,and reduced the level of anti-apoptosis protein Bcl-2;meanwhile it reduced cell viability rate in a dose-dependent manner.In addition,in the TM treated group the PERK-eIF2α-ATF4 signaling pathway was partly activated,which significantly induced expressions of FGF21,p-FGFR1 and β-Klotho when the concentration of TM was≤10 μmol/L.However,when the concentration of TM was＞10 μmol/L,the expression of CHOP was significantly induced through fully-activated PERK-eIF2α-ATF4 signaling pathway,but the expressions of FGF21,p-FGFR1 and β-Klotho gradually decreased with the increase of ERS level.ConclusionsThe expressions of FGF21 and its main receptors correlate with the degree of ERS.Mild ERS(TM≤10 μmol/L)induces the expression of FGF21 and its main receptors in cardiomyocytes,while excessive ERS(TM＞10 μmol/L)relatively reduces their expressions.The mechanism might be partly related to the regulation of PERK-eIF2α-ATF4 pathway in ERS.

endoplasmic reticulum stress;fibroblast growth factor 21;cardiomyocyte

R54

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.001

1005-8982（2017）01-0001-05

2016-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81571636）；山東省自然科學(xué)基金（No：ZR2015HM058）

楊軍，E-mail：yangjun19640124@163.com