神經突起生長因子蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

童瑩，張嶠，單莉

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內一病區，新疆省烏魯木齊市830011）

臨床論著

神經突起生長因子蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

童瑩，張嶠，單莉

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內一病區，新疆省烏魯木齊市830011）

目的探討Neuritin蛋白在非小細胞肺癌（NSCLC）組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的相關性。方法收集在該院行手術切除的87例NSCLC組織及其對應的87例癌旁組織，采用免疫組織化學法檢測癌及癌旁組織中神經突起生長因子（Neuritin）蛋白的表達，并根據二級計分法將其分為低表達和高表達部分，分析Neuritin蛋白表達水平與臨床病理參數[病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結有無轉移、表皮生長因子受體（EGFR）表達等]的相關性。結果Neuritin蛋白的陽性表達位于細胞質，NSCLC組織中Neuritin蛋白以高表達為主，其表達率為75.86％（66/87），遠高于癌旁組織的31.03％（27/87），差異有統計學意義（P＜0.05）；且NSCLC組織中Neuritin蛋白表達水平與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關（P＜0.05），與年齡、性別、吸煙與否、腫瘤部位、有無淋巴結轉移無關（P＞0.05）；Neuritin高表達組的中位疾病無進展生存期（PFS）為16個月，低表達組的PFS為13個月，差異無統計學意義（P＞0.05）；隨訪數據中Neuritin高表達組的中位總生存期為37個月，低表達組為47個月，差異無統計學意義（P＞0.05）；結論Neuritin蛋白在NSCLC及其癌旁組織中均有表達，其中在NSCLC組織中呈高表達，且與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關，提示Neuritin可能在NSCLC的發生、發展中發揮一定作用。

神經突起蛋白；非小細胞肺癌；免疫組織化學法

目前肺癌發病率居世界癌癥首位，20世紀以來，由于環境惡化、職業暴露和吸煙人口的上升，肺癌的發病率和死亡率也急劇的上升，其中有75％～80％患者為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1]，其5年生存率較低，＞90％患者死于浸潤轉移和復發，某些基因的異常表達是導致NSCLC不良預后的重要原因[2]。近年來，NSCLC的治療及其進展是研究熱點之一。神經突起生長因子（Neuritin）是一種與神經系統可塑性相關的神經營養因子[3]，既往多項研究顯示，Neuritin高表達于多種腫瘤組織中，其過表達對腫瘤血管的生長有促進作用[4]，是一種潛在可能的促腫瘤生長因子。但Neuritin蛋白在實際肺癌組織中的表達情況及其與臨床病理資料的關系目前尚不明確。因此本實驗在前期研究的基礎上，檢測Neuritin蛋白在NSCLC及其癌旁組織中的表達，并通過收集一般資料及隨訪生存情況，探討其與臨床病理參數和預后的相關性，為后續機制學研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年8月-2014年2月在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院經病理確診的87例NSCLC患者，取經手術切除的87例癌組織石蠟標本及其87例對應癌旁組織，標本均按照術后外科病理分期收集。其中，男性54例，女性33例；年齡40～75歲，中位年齡62歲；病理類型：腺癌54例，鱗癌33例；分化程度：低分化24例，中分化33例，30例分化程度不明；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期42例，Ⅳ期6例；腫瘤部位：周圍型69例，中央型18例；腫瘤大小：≤3 cm者15例，＞3 cm者72例；45例有吸煙史，51例有淋巴結轉移；行表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因檢測者60例，其中21例突變型，39例野生型。主要試劑：兔抗人Neuritin抗體購于美國Prosci公司，第二抗體購于為北京中衫金橋公司（pv-6000）。

1.2 免疫組織化學法染色

切片開始前將組織蠟塊置于冰凍切片機內復溫30 min，修整組織使組織面最大程度暴露，按照5μm厚度進行連續切片，采用Envision兩步法：切片脫蠟至水，95℃加熱15 min以修復抗原，雙氧水H2O2孵育10 min以減少背景染色。4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）振洗3次，5 min/次；滴加第二抗體，37℃孵育30 min；PBS振洗3次，5 min/次。二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色后進行蘇木素核復染、脫水、透明、封片、干燥。每次實驗均以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學法結果評判標準

均由兩位病理醫生采用雙盲法閱片，Neuritin陽性染色定位于胞漿，采用陽性細胞計數與染色強度相結合的二級計分法。染色強度分類（按切片中細胞顯色有無及深淺評分）：0分細胞無著色；1分顯色為淺黃色；2分為深黃色；3分為棕褐色。取10個高倍鏡視野中每100個細胞中陽性細胞所占百分比的平均值為陽性細胞計數，1分：顯色細胞占切片中細胞總數的1/3以下；2分：1/3～2/3細胞顯色；3分：2/3以上細胞顯色。將兩組評分相乘，按積分高低分為：＜1分：陰性（-）；2～4分：陽性（+）；＞5分：強陽性（++）。

1.4 評價指標

分析NSCLC組織及對應癌旁組織中Neuritin蛋白表達情況，并分析其與臨床病理參數（性別、年齡、吸煙與否、腫瘤部位、病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結有無轉移、EGFR表達）的相關性。

1.5 隨訪

采用電話、門診復診等手段對患者進行隨訪，截止時間為2015年10月31日，87例NSCLC患者失訪6例，隨訪率為93.10％。疾病無進展生存期（progression free survival，PFS）的定義為自手術或治療當日至患者出現疾病進展或死亡的時間。總生存期（overall survival，OS）的定義為自手術或治療當日至患者死亡的時間。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件，計數資料以率表示，用χ2檢驗，采用Person相關檢驗分析Neuritin與臨床病理參數間的相關性，Kaplan-Meier法進行生存分析并行Log-rank比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Neuritin蛋白在NCSLC組織及其癌旁組織中的表達

Neuritin表達的陽性部位均位于胞漿，著色為黃色、棕黃色或棕褐色；且NSCLC組織中Neuritin以高表達為主，本實驗87例NSCLC組織中有66例表達呈強陽性，21例為弱陽性，其高表達率為75.86％，遠高于癌旁組織的31.03％（27/87），差異有統計學意義（χ2=35.133，P=0.000）。見圖1。

2.2 Neuritin蛋白的陽性表達率與非小細胞肺癌患者臨床病理參數的相關性

NSCLC組織中Neuritin蛋白表達水平與年齡、性別、吸煙與否、腫瘤部位、有無淋巴結轉移無關（P＞0.05），與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關（P＜0.05）；其中病理類型鱗癌的高表達率高于腺癌（90.91％vs 66.67％）；分化程度中低分化者高表達率高于中分化者（87.50％vs 63.64％）；腫瘤直徑＞3 cm者的高表達率高于腫瘤直徑≤3 cm者（40.00％vs 83.33％）；EGFR基因野生型者的高表達率高于EGFR基因突變型者（92.31％ vs 71.43％）。見附表。

2.3 Neuritin蛋白的陽性表達率與預后的關系

圖1 Neuritin在NSCLC組織及其癌旁正常組織中的表達（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法×40）

附表NSCLC臨床病理參數與Neuritin蛋白表達水平的關系例

全組隨訪18～49個月，中位隨訪時間27個月。全組失訪6例，隨訪率為93.10％；另有3例因術后感染等嚴重并發癥死亡出組，84例NSCLC隨訪數據中有51例疾病進展，33例無疾病進展，21例死亡，57例至隨訪結束仍然存活。①Neuritin高表達組的中位疾病PFS為16個月，95％CI為（4.791，27.209），低表達組的PFS為13個月，95％CI為（7.019，18.981），差異無統計學意義（P=0.086）；②Neuritin高表達組的中位OS為37個月，低表達組的為47個月，差異無統計學意義（P=0.092）。見圖2、3。

圖3 Neuritin表達水平的總生存曲線分析

3 討論

Neuritin是一種與長期可塑性相關的腦源性神經營養因子，最早由NEDIVI等[5]從大鼠海馬齒狀回中分離得到的，又稱cpg15。以往研究多集中于神經系統中，其表達產物參與神經發育的多個過程[3，6]，也是中樞神經系統疾病治療的一個潛在靶點[7]。而RAGGO等[8]在卡波氏肉瘤的研究中，首次發現裸鼠體內注射穩定表達Neuritin的細胞一段時間后，在相應部位有腫瘤形成，且Neuritin過表達的腫瘤體積較對照組明顯增大，是卡波氏肉瘤發生一個重要環節。近年來國內外不斷有研究發現，Neuritin不僅表達于肺、肝等一些血供豐富的正常組織中，同時也高表達于多種腫瘤如肺癌、胃癌、腎母細胞瘤、結腸癌等組織中，且其過表達對腫瘤血管尖端細胞、血管內皮細胞的生長有促進作用，而腫瘤細胞失去控制的異常增殖需依賴新生血管網的形成，為其提供充分的血供及營養，這提示Neuritin是一種潛在的可能促進腫瘤血管生長因子[9-12]。陳友林[13]發現，Neuritin在腦膠質瘤中的表達強度與膠質瘤的病理分級、惡性程度呈正相關。曹健等[14]發現，Neuritin在乳腺癌組織中Neuritin的陽性表達率與乳腺癌淋巴結轉移、TNM分期及ER/PR/HER2高陽性率有關，提示Neuritin在惡性腫瘤的發生、發展中發揮一定作用。

本研究初步發現，Neuritin在NSCLC及其癌旁組織中均有表達，其表達部位均位于胞漿。顯微鏡下大部分癌旁組織切片中Neuritin著色為黃色或淡黃色，著色細胞比例為30％～60％，而NSCLC組織切片中Neuritin著色為棕黃色或棕褐色，著色細胞比例多＞60％，提示Neuritin在NSCLC組織中存在高表達，而在癌旁組織為低表達。Neuritin在多種惡性腫瘤組織中存在高表達，提示Neuritin本身可能作為一種腫瘤相關生長因子在腫瘤的發生、發展中發揮一定作用。本研究相關性分析顯示，NSCLC組織中Neuritin蛋白表達水平與年齡、性別、吸煙與否、腫瘤部位、有無淋巴結轉移無關，但與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關。其中在鱗癌中的表達高于腺癌，在低分化NSCLC中表達高于中分化者，在腫瘤直徑＞3 cm的NSCLC中表達高于腫瘤直徑≥3 cm者，在EGFR基因野生型中表達高于EGFR基因突變型。該結果與陳友林[13]、曹健等[14]的在乳腺癌、腦膠質瘤等腫瘤中表達趨勢一致。對于惡性腫瘤，其與供養血管關系密切，腫瘤分化程度越低、體積越大者，供養血管越豐富，微血管密度越高。也有體外實驗證實Neuritin在人非小細胞肺癌血管內皮細胞株中表達明顯高于肺微血管內皮細胞株[15]，提示Neuritin可能作為一種潛在的促腫瘤血管生長因子在NSCLC的發展中發揮一定作用。而Neuritin與EGFR基因關系的具體機制尚不明確，兩者可能有共同的相關傳導通路，有待進一步明確。

另外本研究預后分析顯示，從Neuritin不同表達水平的中位PFS和OS生存曲線圖可見，兩條曲線差異無統計學意義。由于本研究受標本數量、隨訪時間的限制，刪失數據偏多，以及影響OS的因素眾多，需后續進一步增加樣本量及延長隨訪時間加以證實。

綜上所述，本研究初步顯示，Neuritin蛋白在NSCLC組織與癌旁正常組織中的表達水平比較，差異有統計學意義。NSCLC組織中Neuritin存在高表達，并且與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關。后續進一步探討NSCLC與Neuritin的相互關系，將有助于對NSCLC的認識，進而為腫瘤基因治療提供新的靶點和理論依據。

綜上所述，Neuritin蛋白在NSCLC組織中存在高表達，且與NSCLC的病理類型、分化程度、腫瘤大小及EGFR基因突變相關，提示Neuritin蛋白可能在NSCLC的發生、發展中發揮一定作用，可能成為肺癌預防和治療的一個新靶點。但Neuritin蛋白在腫瘤組織中的具體作用機制還需大量臨床隨機、多中心的相關研究。

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（童穎丹 編輯）

Expression and clinical significance of neuritin protein in non-small cell lung carcinoma

Ying Tong,Qiao Zhang,Li Shan
(The First Department Of Lung Cancer,Tumor Hospital Affiliated To Xinjiang Medical Univercity,Urumq,Xinjiang 830011,China)

ObjectiveTo investigate the expression status of neuritin protein and its association with clinical pathological features and prognosis in non-small cell lung carcinoma(NSCLC).MethodsNSCLC tissues and the corresponding para-cancerous tissues were collected from 87 cases in our hospital.SP immunohistochemistry was used to detect neuritin expression in both NSCLC and para-cancerous tissues.The neuritin expression level was divided into low expression and high expression according to the two-grade scoring method. The relationships between neuritin expression level and clinical pathological parameters(pathological type, differentiation,tumor size,lymph node metastasis and EGFR gene)were analyzed.ResultsThe positive particles of neuritin were located in the cytoplasm.The positive rate of neuritin in the NSCLC tissues(75.86％, 66/87)was significantly higher than that in the para-cancerous tissues(31.03％,27/87;P＜0.05).Neuritin expression in the NSCLC tissues was correlated with pathological type,differentiation,tumor size andEGFR gene mutation(P＜0.05);and had no relationship with gender,age,smoking history,tumor location or lymph node metastasis(P＞0.05).The median progression free survival(PFS)had no statistical significance betweenthe high-expression(16 months)and low-expression(13 months)groups(P＞0.05).The median overall survival(OS)was 37 months in the neuritin high-expression group and 47 months in the neuritin low-expression group without significant difference(P＞0.05).ConclusionsNeuritin protein is expressed in both NSCLC and para-carcinoma tissues,but highly expressed in NSCLC tissues.Neuritin expression is correlated with pathological type,differentiation,tumor size andEGFRgene mutation in NSCLC.It may play an important role in the occurrence and development of NSCLC.

neuritin;non-small cell lung carcinoma;immunohistochemistry

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.015

1005-8982（2017）01-0077-05

2015-12-28

單莉，E-mail：84972673@qq.com