肺癌腫瘤標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原適配子的篩選及其應(yīng)用

趙運(yùn)旺，朱家寧

西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730070

技術(shù)方法

肺癌腫瘤標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原適配子的篩選及其應(yīng)用

趙運(yùn)旺，朱家寧

西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730070

目的提出一種基于適配子快速檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物的方法。方法利用指數(shù)級(jí)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選其高特異性適配子，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)親和力，最終選出一條高親和力、強(qiáng)特異性的適配子。枸櫞酸鈉還原法制備納米金顆粒。建立基于免標(biāo)記納米金和適配子的分析方法，并對(duì)其方法進(jìn)行考察。結(jié)果通過6輪篩選得到三條NSE的高特異性、強(qiáng)親和力的適配子，其中，a適配子特異性最高。同時(shí)利用篩選得到的肺癌腫瘤標(biāo)志物a適配子和納米金顆粒建立一種快速檢測(cè)NSE抗原的方法。結(jié)論該方法具有較好的準(zhǔn)確度，為肺癌的早期檢測(cè)提供了一種新的手段。

神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原；適配子；納米金；肺癌；腫瘤標(biāo)志物

肺癌是目前世界范圍內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。大部分患者就診時(shí)已經(jīng)是肺癌中晚期，從而導(dǎo)致失去了最佳的治療時(shí)機(jī)。肺癌患者的5年生存率極低，僅有5％～10％［1］。因此，早期診斷對(duì)提高肺癌病人生存率尤為關(guān)鍵。目前臨床上采用肺癌血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的診斷手段，提高了肺癌診斷的準(zhǔn)確性、靈敏度［2］。目前，常見的肺癌血清腫瘤標(biāo)志物有：神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白19片段等［3］。其中NSE已經(jīng)證明可以作為肺癌早期檢測(cè)的判斷指標(biāo)。

適配子是一種具有高親和力、強(qiáng)特異性的識(shí)別靶標(biāo)的單鏈DNA或RNA［4］，與蛋白質(zhì)結(jié)合的適配子因其單鏈核酸的堿基序列多樣性及結(jié)構(gòu)多樣性，可通過形成發(fā)卡、莖環(huán)、G-四鏈體等二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的空間結(jié)構(gòu)匹配，形成與靶分子高親和力和強(qiáng)特異性結(jié)合。其具有優(yōu)于傳統(tǒng)抗體的諸多優(yōu)點(diǎn)，例如：作用的靶分子范圍廣泛，無免疫原性，穩(wěn)定性好，易于修飾等，因而可以代替抗體應(yīng)用于臨床檢測(cè)和治療［5-7］。因此選用NSE抗原作為靶標(biāo)分子，主要依賴于傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)采取的消減SELEX技術(shù)是一種改良后的SELEX技術(shù)，主要原理為SELEX篩選時(shí)去除與非特異性靶標(biāo)分子結(jié)合的寡核苷酸序列，然后將消減后的寡核苷酸序列與目標(biāo)靶分子結(jié)合進(jìn)行正篩。篩選得到高特異性、強(qiáng)親和力的NSE抗原適配子，利用該適配子和納米金顆粒建立了一種快速檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物NSE抗原的方法。為肺癌的早期診斷提供一種新的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

ssDNA文庫：5'-GCAATGGTACGGTACTTCCN30-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'，上游引物：5'-GCAATGGTACGGTACTTCC-3'，下游引物：5'-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'，帶生物素的下游引物：Bio-5'-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'，ssDNA文庫和引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

試劑：NSE抗原（2 mg/mL），NSE抗體（2 mg/mL）購自Sigma，磁珠、鏈霉親和素磁珠購自Promega，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自TOYOBO，PBS購自上海生工。其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 NSE抗原適配子的篩選

1.2.1 NSE抗原與磁珠結(jié)合將1×106磁珠，加入0.1 mol/L碳二亞胺EDC，0.1 mol/L N-N-羥基琥珀酰亞胺NHS各1 mL，室溫下活化30 min。PBS洗3遍，將活化好的磁珠平均分成兩份，分別標(biāo)記為“+”、“-”，將1 μL NSE抗原與標(biāo)記有“+”的磁珠混合，37℃震蕩2 h，PBS洗3遍，4℃保存?zhèn)溆谩? μL NSE抗體與標(biāo)記有“-”的磁珠混合，與NSE抗原方法一致。

1.2.2 NSE抗原適配子篩選取100 pmol的ssDNA文庫，用PBS稀釋到1 mL，充分混勻，95℃、10 min及4℃、10 min。將預(yù)處理好的ssDNA文庫與NSE抗體-磁珠復(fù)合物孵育，37℃震蕩1 h，分離磁珠，回收上清，將上清與NSE抗原-磁珠復(fù)合物孵育，37℃震蕩1 h。PBS洗磁珠，加入200 μL純水，95℃加熱5 min，回收上清。1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增富集取180 μL RT-PCR反應(yīng)體系各加入1 μL上游引物和帶生物素的下游引物，加入18 μL ssDNA模板10 μL，充分混勻，20 μL∕管分裝，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增到S型曲線最高點(diǎn)停止擴(kuò)增。

1.2.4 ssDNA次級(jí)庫的制備將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與偶聯(lián)鏈霉親和素磁珠，37℃，孵育45 min，在堿性條件下變性得到ssDNA，用于下一步的篩選。

1.2.5 RT-PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)篩選進(jìn)程將每輪篩選得到的次級(jí)ssDNA文庫與NSE抗原-磁珠復(fù)合物，37℃孵育30 min，PBS洗滌3遍，RT-PCR檢測(cè)特異性NSE抗原ss-DNA富集的變化。

1.2.6 克隆與測(cè)序?qū)⒌?輪富集的ssDNA次級(jí)文庫用不帶生物素的引物擴(kuò)增成dsDNA。將1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL T載體混勻，37℃反應(yīng)5 min。將連接后的產(chǎn)物與50 μL Trans-T感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，冰浴30 min。42℃熱激30 s，立即置于冰上2 min。取200 μL菌液涂板，培養(yǎng)12 h。挑取邊緣光滑的白色單克隆至0.5 mL含氨芐和卡納霉素的培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。挑選陽性克隆團(tuán)，送公司測(cè)序。

1.2.7 NSE抗原適配子的親和力檢測(cè)10 μL NSE抗原包被微孔板，4℃過夜。將標(biāo)記有FITC的適配子a、b、c稀釋為不同的濃度，分別加入到NSE抗原包被的96孔板中，37℃，孵育1 h。洗去不能結(jié)合NSE抗原的非特異性ssDNA，熒光儀測(cè)測(cè)定其熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)460 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm［8］。同時(shí)每組設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)。與NSE抗原結(jié)合的特異性的ssDNA的量可以通過測(cè)定熒光值的大小，同時(shí)參考其標(biāo)準(zhǔn)曲線來獲得，根據(jù)計(jì)算得到的NSE抗原ssDNA的量進(jìn)行非線性回歸，分析得到NSE抗原適配子的解離常數(shù)（Kd）值。

1.2.8 適配子與肺癌血清特異性結(jié)合檢測(cè)取1×106磁珠，平均分成兩份，分別標(biāo)記為“+”“-”，200 μL肺癌血清與標(biāo)記有“+”的磁珠混合，200 μL正常人血清與標(biāo)記有“-”的磁珠混合，37℃震蕩1 h，PBS洗3遍，在“+”、“-”中分別加入FITC標(biāo)記的a適配子100 μL，室溫振蕩30 min，PBS洗3遍。用流式細(xì)胞術(shù)分析磁珠表面的熒光強(qiáng)度。

1.2.9 NSE抗原適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析模擬使用DNAMAN軟件，分析模擬NSE抗原適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 快速檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物NSE納米金-適配子檢測(cè)體系的建立

納米金顆粒是用氯金酸的檸檬酸還原法制得［9］。將NSE抗原適配子用PBS稀釋成0.1 mmol∕L，向酶標(biāo)板中各加入50 μL的適配子溶液，然后加入不同濃度的NSE抗原，37℃孵育30 min，加入50 μL的納米金顆粒溶液，37℃，孵育30 min，再加入50 mmol/L的NaCl溶液混勻，進(jìn)行光譜分析，繪制得到對(duì)應(yīng)的納米金-適配子檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取濃度為1600、200、12.5 nmol/L的溶液用上述方法分別測(cè)定，一次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)濃度分別設(shè)置3份重復(fù)，并設(shè)置不含NSE抗原的空白對(duì)照。按照上述方法分別檢測(cè)A700和A520，計(jì)算出A700/A520的數(shù)值，最后以A700/A520的均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差的和代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，即可得到檢出限［10-12］。

2 結(jié)果

2.1 篩選富集過程

經(jīng)過6輪SELEX篩選富集后（圖1），通過RT-PCR檢測(cè)，在第4輪時(shí)，檢測(cè)到與NSE抗原-磁珠復(fù)合物結(jié)合的ssDNA明顯地比與NSE抗體-磁珠復(fù)合物結(jié)合的ssDNA多，說明與NSE抗原結(jié)合的適配子已經(jīng)富集，直到第6輪篩選，適配體富集已經(jīng)達(dá)到飽和。

圖1 SELEX技術(shù)篩選流程

2.2 NSE抗原適配子測(cè)序結(jié)果

第6輪篩選得到的ssDNA文庫，經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化到Trans-T感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)獲得單克隆菌落。經(jīng)測(cè)序獲得3條適配子序列（表1）。

表1 適配子測(cè)序序列

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)a適配子與肺癌血清、正常人血清的結(jié)合

2.3 適配子與NSE抗原結(jié)合的特異性考察

對(duì)a、b、c三個(gè)適配子進(jìn)行親和力檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，在一定的范圍內(nèi)，測(cè)定的熒光值與三條適配子的濃度呈正比關(guān)系，這也說明篩選得到的3條NSE抗原適配子都與NSE抗原具有較高的親和力。經(jīng)過計(jì)算，3條適配子的Kd值都達(dá)到了納摩爾級(jí)，適配子a與NSE抗原的親和力最強(qiáng)。

圖2 適配子親和力檢測(cè)結(jié)果

2.4 適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)DNAman軟件分析模擬適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)可知，篩選得到的這3條適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)為莖環(huán)和口袋結(jié)構(gòu)，環(huán)主要為凸環(huán)和圓環(huán)（圖3）。適配子的特異性二級(jí)結(jié)構(gòu)決定了其與NSE抗原結(jié)合的方式。

圖3 適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 NSE抗原適配子與肺癌血清結(jié)合的特異性考察

NSE抗原適配子與肺癌血清結(jié)合的特異性考察結(jié)果顯示，a適配子與正常人血清結(jié)合明顯弱于與肺癌血清的結(jié)合（圖4）。

2.6 納米金顆粒-適配子檢測(cè)體系的建立

當(dāng)適配子的濃度在12.5～600 nmol/L時(shí)，適配子濃度的對(duì)數(shù)與A700/A520呈負(fù)相關(guān)，線性方程是y=－0.542x+1.899，R2=0.9896，其中y表示A700/A520，x表示濃度的對(duì)數(shù)（圖5）。

圖5 適配子濃度對(duì)數(shù)與吸光值之間的關(guān)系

3 討論

適配子是一類大小為70～80 bp左右的寡核苷酸分子，可以與靶標(biāo)分子高親和力、強(qiáng)特異性地結(jié)合，在一定的情況下，還可能發(fā)揮某些生物學(xué)效應(yīng)。因?yàn)檫m配子具有靶分子范圍廣、相對(duì)分子質(zhì)量小、無免疫原性、易于人工合成、修飾和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，適配子在臨床診斷、基礎(chǔ)研究，甚至在疾病治療領(lǐng)域中都顯現(xiàn)其重要的應(yīng)用價(jià)值。因此適配子能夠成為最具前景的抗體替代品。ssDNA文庫可以形成發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)和G-四分體等空間結(jié)構(gòu)，然后與靶分子穩(wěn)定地結(jié)合，通過篩選和富集，最終獲得高親和力、高特異性的寡核苷酸序列。1990年Tuerk等［13］最早通過經(jīng)典SELEX技術(shù)篩選到噬菌體T4 DNA聚合酶的RNA適配子。Fang等［14］利用合成的DNA適配子與熒光淬滅方法可以高通量地檢測(cè)和區(qū)分體液中不同種類的蛋白質(zhì)。NSE抗原是肺癌腫瘤標(biāo)志物之一，而本研究則利用消減SELEX技術(shù)，以磁珠為篩選介質(zhì)，通過6輪快速篩選得到適配子，并利用該適配子和納米金顆粒建立了一種快速檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物的方法。該實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)不足40 min，同時(shí)免去ELISA中的反復(fù)洗板過程，成為本研究最大亮點(diǎn)。

消減SELEX篩選是個(gè)循序漸進(jìn)的過程，每輪篩選效率的高低決定了篩選輪數(shù)的多少。本研究在前幾輪的篩選中，投入較高量的NSE抗原與ssDNA文庫孵育，使ssDNA文庫中能與NSE抗原特異性結(jié)合的ssDNA盡可能多的保留。在后續(xù)的篩選中，當(dāng)特異性結(jié)合的ssDNA通過RT-PCR擴(kuò)增得到富集，隨著篩選輪數(shù)的增加，逐漸減少NSE抗原的投入量，從而增加ssDNA與NSE抗原之間結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)力，從而提高了篩選效率，使特異性結(jié)合的ssDNA快速富集。同時(shí)為了提高篩選的特異性，增加了反篩。通過RT-PCR檢測(cè)篩選進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)第4輪適配子已經(jīng)開始富集，經(jīng)過6輪篩選，適配體富集已經(jīng)達(dá)到飽和。

利用DNAMAN軟件分析模擬適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，篩選得到的適配子結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)口袋為主，這可能是NSE抗原與適配子結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過測(cè)定每個(gè)適配子的親和0力，結(jié)果顯示a適配子與NSE抗原的親和力最高，大口袋小莖環(huán)結(jié)構(gòu)的適配子與NSE抗原的結(jié)合最緊密。

由于納米金顆粒具有獨(dú)特的生物化學(xué)性質(zhì)和生物相容性，當(dāng)適配子結(jié)合到納米金的表面，使其表面帶有高密度的負(fù)電荷，這樣即使在高濃度的鹽溶液中納米金顆粒仍然是保持分散狀態(tài)[15-17]。當(dāng)待測(cè)血樣中有NSE抗原時(shí)，適配子-NSE抗原復(fù)合物形成，適配子折疊形成穩(wěn)定的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這樣在一定濃度的鹽溶液中，納米金聚集，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。利用這一反應(yīng)原理，本研究設(shè)計(jì)出一種能夠快速檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物NSE的方法，并得到了適配子濃度對(duì)數(shù)與吸光值之間的關(guān)系。為肺癌的早期檢測(cè)提供了一種新的分子生物學(xué)方法。同時(shí)也有利于進(jìn)一步研究各適配體與肺癌腫瘤標(biāo)志物NSE的親和力和結(jié)合位點(diǎn)。

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An aptamer-based analytical method for rapid detection of lung cancer tumor markers NSE antigen

ZHAO Yunwang,ZHU Jianing
College of Chemistry and Chemical Engineering,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China

Objective To explore a new aptamer-based rapid detection method for lung cancer tumor markers.Methods Highly specific adaptive were screened by using systematic evolution of ligands(SELEX)and affinity were detected by flow cytometry. So as to choose a high affinity and high specificity of aptamer.Gold nanoparticles were prepared through sodium citrate reduction.The method based on label-free analysis of gold nanoparticles and aptamers were established,with methodological investigation.Results High specificity and strong affinity of 3 NSE were obtained through 6 rounds of screening,with highest specificity of a.A rapid method for the detection of NSE antigen were established through the selection of tumor markers of lung cancer and gold nanoparticles.Conclusion The method has a good accuracy for the early detection of lung cancer provides a new means.

NSE antigen;aptamers;nanometer gold;lung cancer;tumor markers

2016-09-13

國家自然科學(xué)基金（81360333）

趙運(yùn)旺，碩士，E-mail:1021357025@qq.com