embB基因突變與乙胺丁醇藥敏表型及耐多藥關系的研究

劉厚明曾敏李全趙艷敏鄒婧林牧趙丹肖顏玉鄧群益單萬水★

embB基因突變與乙胺丁醇藥敏表型及耐多藥關系的研究

劉厚明1曾敏2李全2趙艷敏2鄒婧2林牧1趙丹3肖顏玉1鄧群益4單萬水1★

目的研究結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）embB306位點及其他突變位點與乙胺丁醇（ethambutol，EMB）的耐藥表型及耐多藥（multidrug resistant，MDR）的關系；分析embB基因突變與EMB藥敏表型及MDR的關系。方法對臨床分離的MTB采用BD MGIT 960 SIRE試劑比例法進行藥敏試驗，取48株EMB耐藥、46株EMB敏感但耐其他藥及7株四藥均敏感MTB提取核酸并擴增embB基因全序列，對擴增產物進行測序分析embB基因序列，與H37Rv標準株序列比對，分析embB基因各突變位點、形式及頻率。結果101株MTB發現embB基因序列上有17個不同位點突變形式。53株MTB在embB基因序列上發生突變，其中46株為EMB耐藥，7株為EMB敏感；embB基因野生型的MTB有48株，其中2株為EMB耐藥，46株為EMB敏感；embB突變型與embB野生型的MTB之間EMB耐藥率有顯著性差異（χ2= 68.95，P＜0.01）。101株MTB中MDR有51株，其中有42株發生embB突變，9株為embB基因野生型，embB基因突變率在MDR和非MDR之間有顯著性差異（χ2=36.9，P＜0.01）。結論embB306位點與EMB耐藥及MDR中度相關，embB基因突變與EMB耐藥及耐多藥結核菌（multidrug resistant?Mycobacterium tuberculosis，MDR?TB）高度相關，embB基因突變可作為MDR?TB的檢測分子標記物，指導臨床用藥。

結核分枝桿菌；embB基因；突變；乙胺丁醇；耐多藥

據世界衛生組織2013年調查數據顯示，中國的結核病患者約為85.5萬人，其中耐多藥（multi?drug resistant，MDR）結核病患者約為5.4萬人，我國的結核病和MDR結核病患病嚴重程度僅次于印度［1］，為世界第二大結核病和MDR結核病負擔大國，控制耐藥和MDR結核病的流行已經成為中國結防工作的迫切任務。

乙胺丁醇（ethambutol，EMB）是治療結核病的一線用藥之一，EMB作用于靶分子阿拉伯糖基轉移酶，抑制了阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳糖，從而影響MTB的細胞壁分枝菌酸?阿拉伯半乳聚糖?肽聚糖復合物的形成，發揮抑菌作用，使靶分子在細胞內的藥物更容易進入細胞，使聯合用藥發揮協同作用［2］。

目前大部分研究認為MTB耐EMB與阿拉伯糖基轉移酶的編碼基因embABC操縱子表達增高或突變有關，其中embB基因突變改變了阿拉伯糖基轉移酶結構，從而引起耐藥［3］。Morkrouslv等［4］對embB306與臨床結核病的EMB耐藥關系之間研究顯示embB序列中306位點突變最常見（約48.3％的EMB耐藥和32.5％的EMB敏感但耐其他一線藥的MTB發生306位點突變），但是306位點以外的embB基因突變也可引起EMB耐藥，如在耐EMB分離株中，還可以檢測到如下基因位點突變：285Phe→Leu、330Phe→Val、630Thr→Ile等［4?6］，說明除306位點外還存在其他耐EMB MTB的基因突變位點。本研究對深圳市結核病患者分離的MTB embB基因全序列（3 297 bp）進行測序分析，期許發現更多與耐EMB相關的embB突變位點，提高MTB的EMB藥敏鑒定的準確性，可有效控制耐EMB結核病和MDR的流行。

1 材料與方法

1.1 研究對象

對2013年1月至2014年5月來院就診結核病患者9 038份標本進行MTB的分離、培養和鑒定，共分離出MTB 2 243株，對其中865株進行BD MGIT 960 SIRE液體藥敏試驗，選取所有EMB耐藥48株，占5.55％（48/865），取EMB敏感但耐其他藥46株，4種藥物全敏感7株，共計101株進行研究。

1.2 藥物敏感性測定

使用在國際上作為MTB藥物敏感性檢測的“金標準”——比例法，嚴格按照BD MGIT 960 SIRE液體藥敏試驗操作說明書進行，利福平（ri?fampin，RFP）、異煙肼（isonicazide，INH）、EMB和鏈霉素（streptomycin，SM）藥敏判讀折點濃度分別為1 mg/L、0.1 mg/L、5 mg/L和1 mg/L，結果判讀為耐藥（R）或敏感（S）。本文MDR是指至少同時耐利福平和異煙肼，多耐藥是指不同時耐利福平和異煙肼，但至少耐2種藥。

1.3 核酸提取

取MTB培養陽性菌懸液1 mL，80℃滅活60 min，13 300 rpm離心10 min，棄上清；沉淀用1 mL生理鹽水懸浮，13 300 rpm離心10 min，棄上清；重復上述步驟一次。沉淀加入50 μL去離子水，渦旋震蕩混勻，干浴鍋100℃×10 min，13 300 rpm離心10 min，離心后的上清即可作為PCR擴增模板。

1.4 目的基因擴增、測序及測序數據分析

將核酸提取物送至深圳華大基因研究院進行目的基因擴增測序及測序數據分析，根據M.tuber?culosis H37Rv菌株的標準參考序列（GenBank ac?cession no.NC_000962）設計embB基因全序列（3 297 bp）的PCR擴增引物，上游引物（5′?3′）序列為AATCAGGCTCCAGACGC，下游引物（5′?3′）為TACCGAGCAGCATAGGAG。PCR反應條件：（1）94℃，1 min預變性；（2）94℃，30 s變性；（3）58℃，30 s退火；（4）72℃，210 s延伸；（5）步驟（2）～（4）循環30次；（6）72℃，7 min；（7）12℃，保持。采用Sanger測序法對embB基因全序列進行測序，利用軟件DNAstar Lasergene進行序列拼接和與embB基因標準序列的比對，分析突變位點。本研究對embB基因的核苷酸或氨基酸位點均采用大腸桿菌的編號系統進行描述。

1.5 統計學分析

統計學軟件為SPSS 19.0分析數據，兩組間的差異分析采用完全隨機設計的兩樣本率比較（卡方檢驗），P＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 比例法液體藥敏試驗結果

入選的101株MTB標本比例法藥敏試驗，48例EMB耐藥和53例EMB敏感，其中MDR 51株，多重耐藥20株，結果見表1。

表1101 株MTB比例法藥敏結果Table 1Results of drug sensitivity of 101 strains of MTB by ratio method

2.2 基因測序及突變結果

本次研究發現embB序列上出現的基因突變位點一共有17個，已被錄入tbdreamdb結核分枝桿菌基因數據庫［7］的突變位點有306、406、534、328、497（Q→K，Q→R）和1 024位點。未被記錄入tbdreamdb MTB基因數據庫的突變位點有113、201、246、319、330、354、405、573、521、609和679位點以及Q497P、Q497H這2個堿基替換類型。306位點突變有27株菌，26株306位點突變樣本的藥敏表型為EMB耐藥，1株306位點突變的MTB藥敏為EMB敏感。497（Q→K，Q→H，Q→P）、406、328、354、330、319、405、1 024和521位點突變的MTB藥敏為EMB耐藥。246、679、113和534突變位點的MTB藥敏為EMB敏感。201和306位點在一個MTB上聯合突變，其藥敏為EMB耐藥；609和330位點在一個MTB上聯合突變，其藥敏為EMB敏感；246、497（Q→R）和573位點在一個MTB上聯合突變，其藥敏為EMB敏感。具體結果如表2所示。

2.3 基因突變與EMB藥敏相關性分析

101個檢測樣本中53株MTB發生embB基因突變，其中46株embB基因突變為EMB耐藥，占86.8％（46/53），7株embB基因突變為EMB敏感，占13.2％（7/53）；48株embB基因野生型MTB中耐EMB的只有2株，embB基因野生型MTB的EMB耐藥率為4.2％（2/48），46株embB基因野生型MTB為EMB敏感菌株。embB基因突變型與embB基因野生型MTB的EMB耐藥率進行比較，有統計學意義，二者有顯著性差異，embB突變型MTB的EMB耐藥率明顯比embB野生型MTB的EMB耐藥率高。詳細結果見表3。

2.4 基因突變與MDR?TB相關性分析

根據表4，101個樣本中MDR?TB一共有51株，其中embB基因突變型的MDR?TB有42株，占82.3％（42/51）；embB基因野生型的MDR?TB有9株，占17.6％（9/51）。MDR?TB在embB基因突變型和embB基因野生型之間進行比較，有統計學意義，二者有顯著性差異，embB基因突變率MDR?TB較非MDR?TB更高。詳細結果見表5。

3 討論

embB基因突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關系：吳雪瓊等［2，5］相關研究發現36％～69％的MTB耐EMB分離株有embB基因突變，本次研究深圳市MTB基因檢測結果顯示耐EMB的MTB分離株中embB基因突變檢出率為95.8％（46/48），深圳市MTB耐EMB的embB基因突變率更高。embB基因突變型與野生型EMB耐藥率有統計學意義，embB基因突變型比野生型EMB耐藥率明顯增高，提示embB基因突變與EMB耐藥密切相關，與大多數研究文獻的結論一致［5，8?12］。因此筆者認為MTB發生embB基因突變與深圳地區的MTB耐EMB高度相關。

表2 embB各突變位點的氨基酸改變與MTB藥敏結果分析Table 2Analysis of amino acid change and MTB drug sensitivity ofembBin different mutation sites

Ramaswamy等［12］和Shi等［13］文獻指出embB基因突變可能是MDR流行的原因之一。本研究中，MDR?TB在embB基因突變型與野生型之間比較有統計學意義，embB基因突變型MTB MDR率明顯比野生型的MTB MDR率要高，提示embB基因突變與MDR之間高度相關。Shi等［13］在研究河南的結核病embB基因突變特征中發現138株MDR中119株MDR檢測到embB突變，突變率為86.2％（119/138），與本研究結果相似，因此，我們認為embB基因突變可能是深圳市MDR?TB流行的主要原因之一，embB基因突變的檢出可以有效預測深圳市結核病的MDR情況。在尚未發現明確的MDR檢測分子標記物之前，筆者認為embB基因突變可作為診斷MDR?TB的檢測分子標記物。

表3 embB基因突變型與embB基因野生型的MTB的EMB耐藥對比分析（株）Table 3Analysis of drug resistance of EMB betweenembBgene mutation and wild type in MTB(strains)

表4 MDR?TB藥敏情況統計Table 4Results of MDR?TB drug sensitivity

embB306位點突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關系：近年來有大量的文獻和研究表明發生embB突變的EMB耐藥MTB中約有27％～87％的突變發生在306位點上［8?9，14?15］，本研究中，306位點突變菌株為27株，占embB基因突變位點樣本的49.3％（27/53），證實了embB306突變確實與MTB耐EMB有關，但并不能認為embB306位點突變直接導致MTB耐EMB［13，15?17］。本研究單獨檢測embB306突變診斷MTB對EMB耐藥靈敏度54.2％（26/48），通過檢測embB基因所有突變位點，可以提高靈敏度至95.8％（46/48），這提示embB基因上多個位點均可能參與了MTB的EMB耐藥發生，與Shi等［13］的研究結論一致。306位點突變檢測EMB耐藥性在臨床應用上有一定的局限性，但該位點是目前MTB耐EMB的最高頻突變位點。本研究被檢測到embB306位點突變的MTB的EMB耐藥率96.3％（26/27），特異度98.1％（52/53），306位點的檢出提示該菌株對EMB耐藥中度相關。embB基因突變檢測和306位點檢測都可用于臨床MTB的EMB耐藥的預測，embB基因檢測與306位點檢測聯合應用可提高診斷的靈敏度和特異度，可使MTB的EMB藥敏結果更準確可靠。

Safi等［18］的研究以及在筆者［19］以前研究的embB306位點與MDR相關性結論認為embB306不僅與EMB耐藥相關，與其他3種一線藥物RFP、INH和SM也有相關，本研究embB306位點突變MTB的MDR率為81.5％（22/27），embB306位點與MDR相關。張楠等［20］研究認為306位點可以作為MDR?TB的檢測分子標志物，本研究結果顯示MTB發生embB306位點突變的MDR率為43.1％（22/ 51），306位點診斷MDR?TB的靈敏度較低，因此，我們認為306位點作為MDR?TB的檢測分子標志物可靠性一般；發生embB基因突變的MDR率為82.3％（42/51），306位點與其他突變位點聯合應用可提高MDR檢測方法的靈敏度，306位點是embB基因上與MDR?TB相關的一個重要的突變位點在實驗室診斷EMB耐藥和MDR?TB中有較高的參考價值。

表5 embB基因突變型與embB基因野生型的MDR?TB情況對比分析（單位：株）Table 5Analysis of MDR?TB between embB gene mutation and wild type(strains)

embB406和497位點突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關系：有相關研究表明406和497位點是除306位點以外在embB基因上被發現最多的2個突變位點［15］，本研究結果與上述研究一致。本研究embB406位點突變株EMB耐藥率為100％（5/5），MDR率為80％（4/5）；embB497突變株EMB耐藥率為83.3％（5/6），MDR率為83.3％（5/6）。406和497位點的EMB耐藥率和MDR率相當高，近年來越來越多的研究顯示406和497位點與EMB耐藥相關［13，15，21?25］，406位點或497位點發生突變會導致MTB對EMB低濃度耐藥［23］，因此筆者認為406位點和497位點突變與EMB耐藥高度相關，406位點、497位點和306位點都是診斷MTB耐EMB的重要檢測突變位點。

Xu等［15］研究認為EMB耐藥的MTB突變發生在406或497位點上的均為MDR?TB，本研究結果與上述結論不完全相符，但多個研究顯示在MDR?TB中檢測到406或497位點突變的頻率在5％～ 15％之間［13，15，22，24］，我們的結果與之相符。筆者認為emb406和embB497突變位點與MDR?TB耐一線藥相關，是除了306位點以外的另外2個與MDR?TB相關的重要embB突變位點，可應用于臨床診斷MTB的EMB耐藥和MDR相關性的預測。

embB328、354和1024位點突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關系：embB328、354這4個突變位點都被記錄入tbdreamdb數據庫，4個位點突變的MTB藥敏結果都是EMB耐藥，相關的研究顯示embB328［13，15，21，24，26］、354［13，15，21，26］和1024［13，21］位點都是在耐EMB的MTB被檢測到。本研究中，embB328位點突變的MTB有4個，embB354位點突變的MTB有2個，embB1024位點突變的MTB只有1個，這些突變的樣本都是MDR?TB，且都是耐EMB的MTB，筆者認為他們與MTB對EMB耐藥及MDR?TB相關。單獨檢測一個embB306基因位點耐EMB的靈敏度為54.2％（26/48），聯合306、406、497、328、354和1024位點可提高靈敏度至81.3％（39/48），embB328、354和1024位點可應用于預測MTB耐EMB和MDR相關性，為實驗室建立EMB耐藥檢測方法提供了理論依據。

embB405、521、330、319、534、246、113、679、201、609和573位點突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關系：以上突變位點突變株較少，突變位點未被記錄入tbdreamdb數據庫，或雖有記錄入tb?dreamdb數據庫，但相關文獻［13?15，21?24，27］研究沒有指出其突變與EMB藥敏表型及MDR的關系，結合本研究，尚不能確定以上突變位點與MTB的EMB耐藥及MDR之間的關系。

綜上所述，embB306位點與EMB耐藥及MDR中度相關，306位點突變檢測EMB耐藥和MDR在臨床應用上有一定的局限性，與其它位點如embB406、497聯合應用可提高檢測方法的靈敏度，在實驗室診斷EMB耐藥和MDR?TB中有較高的參考價值。embB基因突變與EMB耐藥及MDR高度相關，embB基因突變可作為MDR?TB的檢測分子標記物。embB基因embB306、497、406、328、354、1024、319、330、405和521位點突變與EMB耐藥相關，認為embB基因序列上900～1500位點之間是高頻突變區，與Shi等［13］的研究一致，該序列區域發生突變與EMB耐藥高度相關，我們將其命名為EMB耐藥決定區域（ethambutol resistance determining region，ERDR），為實驗室建立快速診斷MTB的EMB耐藥性和MDR的檢測方法提供了理論依據，為臨床對EMB耐藥MTB感染的治療具有指導意義。

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Assosciation between embB mutation and drug resistance and MDR in Mycobacterium tuberculosis for ethambutol

LIU Houming1,ZENG Min2,LI Quan2,ZHAO Yanmin2,ZOU Jing2,LIN Mu1,ZHAO Dan3,XIAO Yanyu1, DENG Qunyi4,SHAN Wanshui1★
(1.Department of Clinical Laboratory,the Third People's Hospital of Shenzhen City,Shenzhen,Guangdong, China,518112;2.Beijing Genomics Institute?Shenzhen,Shenzhen,Guangdong,China,518083;3.Department of Clinical Laboratory,Luohu Chronic Disease Prevention and Cure Hospital,Shenzhen,Guangdong,China, 518029;4.Department or Tuberculosis,the Third People's Hospital of Shenzhen City,Shenzhen,Guangdong, China,518112)

ObjectiveTo determine Mycobacterium tuberculosis(MTB)embB306 and other loci molecular mutations and their association with ethambutol(EMB)resistance phenotype and multidrug resistant (MDR);to determine molecular mutation in embB gene and its association with EMB resistance phenotype and MDR.MethodsThe drug sensitivity test was carried out using ratio method by BD 960 MGIT SIREreagent for clinical isolates of MTB,the DNA of 48 EMB resistance,46 EMB sensitive but resistance to other drugs and 7 sensitive to four drugs of MTB were extracted and amplified embB gene sequence.The amplified products were then sequenced and analyzed the embB gene sequence of each MTB,compared with H37Rv standard strain in Genbank,the mutation sites,the form and the frequency of embB gene were analyzed. Results17 different mutant forms were found in 101 strains of MTB embB gene.53 strains of MTB mutated in the embB gene,46 strains of which were EMB resistant,7 were EMB sensitive;48 strains of MTB were wild type in the embB gene,2 strains of which were EMB resistant,46 were EMB sensitive.There were significant differences in the drug resistance positive rates of EMB between embB mutation and embB wild type(χ2=68.95, P＜0.01).There were 51 strains MDR in 101 MTB,including 42 strains of embB mutation,and 9 strains of embB wildtype,the mutation rate of embB gene was significantly different between MDR and non?MDR(χ2= 36.9,P＜0.01).ConclusionembB 306 mutation is moderately related to EMB resistance in MTB,mutation of embB gene is highly associated with EMB resistance and MDR?TB,the embB gene can be used as a marker for the detection of MDR?TB,which could be used guideline for clinical drug use.

Mycobacterium tuberculosis;embB gene;Mutation;Ethambutol;MDR

深圳市科技創新委員會基金（JCYJ2013040116479996，JCYJ20140411113637598）；深圳市三名工程專項基金；深圳市科技研發資金（ZDSYS201504301534057）

1.深圳市第三人民醫院檢驗科，廣東，深圳518112 2.深圳華大基因研究院，廣東，深圳518083 3.深圳市羅湖區慢性病防治院檢驗科，廣東，深圳518029 4.深圳市第三人民醫院肺病科，廣東，深圳518112

★通訊作者：單萬水，E?mail：shanwanshui152@aliyun.com