肺癌患者EGFR及KRAS基因突變檢測方法的建立和臨床應(yīng)用

張潔明楊學(xué)習(xí)

·論著·

肺癌患者EGFR及KRAS基因突變檢測方法的建立和臨床應(yīng)用

張潔明1楊學(xué)習(xí)2★

目的本研究擬在評估二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)在肺癌臨床分子診斷中應(yīng)用的可行性。方法本研究選取108例肺癌石蠟包埋樣本（formalin fixed paraffin embedded，F(xiàn)FPE），同時進行一代測序（sanger sequencing）和NGS檢測樣本中EGFR和KRAS基因的突變情況。結(jié)果在108例肺癌樣本中，一代測序檢出突變在二代測序中均檢出，另外NGS還檢測出目標(biāo)區(qū)域外其他突變。結(jié)論NGS的檢測準(zhǔn)確性可達到100％。NGS可以應(yīng)用于肺癌臨床分子診斷，同時NGS能給臨床提供更詳細的基因突變信息，為分子靶向治療提供依據(jù)，更具有市場潛力及應(yīng)用前景。

二代測序；肺癌；EGFR；KRAS

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一［1?2］，同時其也是我國發(fā)病率及致死率最高的癌癥。近年來，分子靶向藥物因其特異、高效、副作用小的特點而得到了廣泛推廣和臨床應(yīng)用。但由于腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生藥物敏感性差異，在給予靶向治療前，需確認特定靶點基因的狀態(tài)，從而評估每位患者對特定藥物的敏感性和毒副反應(yīng)的大小，有針對性地使用抗癌藥物［3］。

肺癌靶向藥物治療的相關(guān)基因包括EGFR和KRAS［4?5］，其突變狀態(tài)的檢查在臨床治療中的意義日益凸顯。目前常規(guī)分子病理檢測方法是采用實時熒光定量核酸擴增檢測（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)或一代測序技術(shù)。qPCR技術(shù)對單個基因已知突變進行定性和定量檢測，一代測序可以測定單個基因指定突變位點的附近序列（限于單個外顯子）。但以上方法僅限于已知突變，且通量低（一般一個反應(yīng)只能檢測一個突變或一個外顯子）、靈敏度低，難以檢出樣本中低豐度突變及未知突變。

第二代測序具有高通量、自動化、低成本的特征，它能在很短的時間內(nèi)完成對上百億堿基的測序，滿足極短時間內(nèi)對基因組進行高分辨率的檢測的要求［6］，它能夠一次檢測多個基因的多個突變熱點附近的序列，從而同時鑒別出已知和未知的突變類型，節(jié)省腫瘤樣本DNA用量，檢測性價比高［7?8］。本研究采用Ion Torrent測序法測定肺癌患者石蠟包埋組織樣本EGFR和KRAS基因突變情況。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit購自德國Qia?gen公司；Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0，Ion PI?Template OT2 Kit v3，Ion PITMHi?QTMSequencing 200 Kit均購自美國Life Technology公司；Nuclease?Free Water購自美國Life Technologies公司；無水乙醇（分析純）購自廣州化學(xué)試劑廠；基因測序儀（DA8600）由中山大學(xué)達安基因股份有限公司提供；ABI 3500由中山大學(xué)達安基因股份有限公司提供。

1.2 研究對象

隨機選取2013年至2015年間寧波市第二醫(yī)院在病理學(xué)上確診為非小細胞肺癌的石蠟包埋組織樣本108例。男性患者58例，女性患者50例，年齡在35歲到88歲之間。研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會審核批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

使用QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit提取石蠟包埋組織樣本DNA。通過脫蠟，溶解細胞，吸附DNA，除雜等步驟獲取DNA。

1.3.2 二代測序

二代測序有4個步驟，分別是基因組DNA提取，文庫構(gòu)建，上機測序和生物信息學(xué)分析，具體內(nèi)容見圖1。根據(jù)測序需要，使用Ion AmpliseqTMli? brary kit 2.0將提取的DNA構(gòu)建成文庫DNA。PCR特異性擴增目的片段，在DNA片段兩端加上通用測序接頭，PCR擴增文庫DNA，磁珠純化去除雜質(zhì)。建庫后使用核酸定量儀測定文庫DNA的濃度。PI芯片一次上機測序能得到的數(shù)據(jù)在10 G左右，根據(jù)每個樣本測序數(shù)據(jù)需求量和測序深度確定混樣個數(shù)，混合樣本，再測定混樣后DNA濃度，稀釋到200 pmol/μL，取800 pmolDNA做模板制備。稀釋倍數(shù)公式如下。使用Ion PI?Template OT2 Kit v3制備測序模板。在PCR反應(yīng)體系中加入文庫DNA和模板載體，油包水PCR，富集測序模板去除雜質(zhì)及擴增失敗的測序模板。使用Ion PITMHi?QTMSequencing 200 Kit在基因測序儀（DA8600）上測序。初始化測序儀，測序模板loading入測序芯片，上機測序。

稀釋倍數(shù)=Qubit濃度（ng/μL）×107/（200× 660×2）。

1.3.3 二代測序數(shù)據(jù)分析

圖1 二代測序流程圖Figure 1Progress of NGS

上機測序數(shù)據(jù)通過Torrent source進行后續(xù)信息分析。運行Variant Caller和Coverage Analysis插件，得到樣本的分析結(jié)果。點擊“篩選”，在“檢測結(jié)果”選項中，篩選保留“雜合突變”和“純合突變”，當(dāng)“突變頻率”值≥5％時，檢測結(jié)果為相應(yīng)基因突變型別；“突變頻率”值＜5％時，檢測結(jié)果為相應(yīng)基因位點野生型。在“突變熱點”選項中顯示“Hotspot”的基因突變?yōu)槌Ｒ娡蛔?，其指示的COSMIC ID可以在COSM網(wǎng)站獲取相應(yīng)的基因突變信息；在“突變熱點”選項中顯示“Novel”的基因突變?yōu)楹币娡蛔兓蛐峦蛔?。Coverage Analysis可顯示“測序深度”及“覆蓋度”，評估測序質(zhì)量。按照上述方法，對收集的石蠟包埋組織樣本進行EGFR和KRAS基因測序。

1.3.4 一代測序

108例FFPE樣本使用一代測序方法進行檢測（本實驗室自行檢測），結(jié)果作為對照。使用步驟1.3.1提取的DNA，進行PCR對目的片段擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果，對擴增產(chǎn)物純化，測序反應(yīng)體系配置，測序反應(yīng)前擴增，使用達瑞生物購置的ABI 3500一代測序儀進行測序。

1.3.5 一代測序數(shù)據(jù)分析

搜索待測突變區(qū)域前序列，比對基因序列，若同時具有突變堿基峰，則為雜合突變；若只出現(xiàn)野生堿基峰，則為野生型；若只出現(xiàn)突變堿基峰，則為純合突變。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果

本次研究收集108例肺癌組織樣本，二代測序結(jié)果顯示EGFR基因野生型87例，EGFR基因突變型共21例，其中L858R突變有15例，E746_A750delELREA突變有3例，L747?T751del、V769_D770insASV均只有1例，雙突變G719S及S768I有1例。KRAS基因突變情況，KRAS基因野生型75例，KRAS基因突變型共33例，其中Gly12Asp突變有15例，Gly12Cys突變有5例，Gly12Val突變有4例，Gly13Asp突變有4例，Gly12Ala突變有2例，Gly12Ser、Gly12Arg均有1例，雙突變Gly12Asp及Gly12Cys有1例。

針對EGFR第18～21號外顯子、KRAS第2號外顯子進行一代測序。結(jié)果顯示EGFR基因野生型87例，EGFR基因突變型共21例，其中L858R突變有15例，E746_A750delELREA突變有3例，L747?T751del、V769_D770insASV均只有1例，雙突變G719S及S768I有1例。KRAS基因野生型75例，KRAS基因突變型共33例，其中Gly12Asp突變有15例，Gly12Cys突變有5例，Gly12Val突變有4例，Gly13Asp突變有4例，Gly12Ala突變有2例，Gly12Ser、Gly12Arg均有1例，雙突變Gly12Asp及Gly12Cys有1例。檢測結(jié)果見表1，文章篇幅有限僅展現(xiàn)10例樣本。

2.22 種測序方法結(jié)果對比

比對一代測序結(jié)果，一代測序檢出突變二代測序均有檢出。EGFR基因檢測2種方法均為陽性共21例，兩種方法均為陰性87例，一代測序陽性二代測序陰性共0例，一代測序陰性二代測序陽性共0例。靈敏性即二代測序檢出突變病例占對照組檢出突變病例的比例，又稱真陽性率。特異性指二代測序檢出無突變病例占對照組未檢出突變總數(shù)的比例，又稱真陰性率。準(zhǔn)確性指真陽性和真陰性占總樣本數(shù)的比例。二者檢測結(jié)果一致，靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性均為100％。KRAS基因檢測兩種方法均為陽性共33例，2種方法均為陰性75例，一代測序陽性二代測序陰性共0例，一代測序陰性二代測序陽性共0例。二者檢測結(jié)果一致，靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性均為100％。

表1 測序檢測結(jié)果Table 1Sequencing results in detail

表2 二代測序檢測結(jié)果Table 2NGS results in detail

2.3 二代測序靈敏性

二代測序還檢測出其他突變，這些都是在一代測序檢測位點外或突變頻率較低的突變。表2為其中5例樣本的檢測結(jié)果。

3 討論

本次實驗檢測2個基因6個外顯子上的突變情況，其中EGFR基因第18～21號外顯子、KRAS基因第2、3號外顯子。實驗中108例樣本二代測序結(jié)果與一代測序目標(biāo)檢測區(qū)域結(jié)果相符。另外，二代測序還檢測出樣本存在其他基因突變，如TP53、PTEN、CTNNB1、PIK3CA、BRAF。二代測序技術(shù)具有高通量的特點，能一次檢測多個基因的多個位點，節(jié)省樣本DNA用量，僅需少量樣本即可檢測大部分基因突變情況，減少采集樣本的難度及降低患者痛苦。一代測序可檢測單個基因突變位點附近的全部序列，但通量低（一般單個測序反應(yīng)只能檢測單個外顯子），只能對突變位點進行定性檢測而不能定量檢測，且其檢測靈敏度不及二代測序，難以檢出樣本中低豐度突變，當(dāng)某一外顯子存在多種突變時，一代測序的峰圖易受干擾，難以判斷突變類型，所以一代測序難以將復(fù)雜突變樣本準(zhǔn)確檢出其突變型。二代測序可以節(jié)省大量檢測時間，特別是需要同時檢測多個基因的情況下，更快得到檢測結(jié)果，及時進行治療。另外，二代測序還可以發(fā)現(xiàn)其他基因上的突變，可以為臨床醫(yī)生提供更多的信息，更利于治療藥物的選擇；還可以發(fā)現(xiàn)新的肺癌相關(guān)基因。二代測序與一代測序檢測結(jié)果高度一致，二代測序在檢測時間和檢測通量上比一代測序更有優(yōu)勢，更能滿足目前臨床檢測及科研實驗的需求。

研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞腫瘤個體化用藥指導(dǎo)治療中，及時了解癌變組織基因突變狀態(tài)至關(guān)重要。根據(jù)自身情況使用相應(yīng)的治療藥物可以有效地控制病情的發(fā)展［9?10］。根據(jù)2014年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）的《非小細胞肺癌臨床實踐指南（中國版）》，KRAS突變和EGFR?TKI內(nèi)源性耐藥有關(guān)，KRAS野生型患者建議接受EGFR?TKI治療［10］。目前化療藥物對癌癥細胞針對性弱，部分患者本身基因存在突變對藥物產(chǎn)生耐性，并且化療藥物副作用大，療程長，治療效果不明顯。靶向治療藥物針對性強，副作用低，通過測序檢測患者基因突變狀態(tài)有利于醫(yī)生選擇治療藥物，及時控制病情，降低患者痛苦和負擔(dān)。本次檢測出EGFR突變型21例，KRAS野生型75例，這些患者對TKI敏感，建議使用吉非替尼、厄洛替尼、尼洛替尼等藥物治療。基因檢測可以及時了解患者基因突變情況，為臨床用藥提供指導(dǎo)，實現(xiàn)個性化用藥。本次檢測僅針對肺癌相關(guān)基因EG?FR和KRAS，但二代測序可以同時檢測多個基因，如NRAS、BRAF、TP53等。NRAS突變存在于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤［11］，在急性粒細胞白血病及骨髓異常增生綜合征中NRAS突變率為25％。BRAF突變存在于結(jié)直腸癌和黑色素瘤［12］。KRAS突變也發(fā)生在胰腺癌和結(jié)直腸癌中［13?14］。大部分甲狀腺癌存在3種癌基因（KRAS、HRAS、NRAS）的突變［15］。TP53突變存在于多種癌癥當(dāng)中。癌癥發(fā)生并不局限于單個基因，而某個基因突變也可能存在于多種癌癥［16］。二代測序不局限于肺癌臨床檢測，也可以應(yīng)用于其他癌癥當(dāng)中，二代測序具有強大的發(fā)展?jié)摿褪袌銮熬啊?/p>

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A new method of gene mutation status detection onEGFRandKRASof lung cancer patients and the assessment of clinical application

ZHANG Jieming1，YANG Xuexi2★
（1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.，LTD.，Guangzhou，Guangdong，China，510665；2.Institute of Antibody Engineering，School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

ObjectiveThe feasibility of application of next generation sequencing(NGS) technology in clinical molecular diagnosis of lung cancer was evaluated in this study.MethodsIn this study,the variants of the EGFR and KRAS genes from 108 paraffin?embedded tissues of lung cancer were detected by both Sanger sequencing and NGS.The variants detected by Sanger sequencing were as also detected by NGS.ResultsIn 108 cases,NGS detected all the mutations which sanger sequencing detected. In addition,NGS also detected other gene mutation status that Sanger sequencing missed.ConclusionThe detection accuracy of NGS could reach 100％.NGS could be used in clinical diagnosis of lung cancer,and NGS can provide more detailed gene mutation information for clinical diagnosis,which provides the basis for molecular targeted therapy.Moreover NGS also has the market potential and application prospects.

Next generation sequencing；Lung cancer；EGFR；KRAS

廣東省科技計劃項目應(yīng)用型專項資金（2015B020233009）

1.廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗與生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所，廣東，廣州510515

★通訊作者：楊學(xué)習(xí)，E?mail：yxxzb@sohu.com