DNA定量分析聯合液基細胞學檢測對惡性腹腔積液的診斷價值

黃柳炎劉崇梅毛敏鄒亞陽娟張雪純

·論著·

DNA定量分析聯合液基細胞學檢測對惡性腹腔積液的診斷價值

黃柳炎1劉崇梅2★毛敏2鄒亞2陽娟1張雪純1

目的探討DNA定量分析和液基細胞學檢測對惡性腹腔積液診斷的應用價值。方法選取我院2013年8月至2015年8月間145名腹腔積液患者作DNA定量分析檢查（DNA image cytometer，DNA?ICM）和液基細胞學檢測（thinprep cytologic test，TCT），比較其二者間診斷的敏感性和特異性。應用Logistic回歸模型，繪制ROC曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC）來評價各指標的診斷價值。結果DNA?ICM檢測的陽性率明顯高于TCT檢測。TCT檢測和DNA?ICM檢測敏感性分別為84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特異性分別為65％（13/20）和85％（17/20）。2種方法聯合診斷惡性腹腔積液的ROC曲線下面積AUC為0.94，高于2種單項檢測的AUC，分別為0.90、0.75。結論兩者相比較，DNA?ICM的敏感性和特異性明顯高于TCT檢測，而將2種方法相結合，可以很大地提高對惡性腹腔積液的診斷準確性。

DNA定量分析；液基細胞學；腹腔積液

腹腔積液是臨床常見癥狀之一，能夠準確的判斷腹腔積液的良惡性，對于疾病的診療有著重要的意義。液基細胞學檢測（thinprep cytologic test，TCT）是鑒別良惡性腹腔積液的重要方法，但惡性腹腔積液細胞學診斷的陽性率僅為40％左右［1］。相關研究報道細胞DNA定量分析（DNA image cytometer，DNA?ICM）檢測腹腔積液中腫瘤細胞敏感性為88.3％，特異性為100％，TCT檢測對惡性腹水診斷的敏感度為81.4％，特異性為90.4％［2?3］。本研究將對145例腹腔積液患者采用TCT檢測和DNA?ICM檢測，對腹水中的細胞核進行DNA倍體定量分析，并對比兩者在惡性腹腔積液的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集岳陽市二人民醫院2013年8月至2015年8月間腹水樣本145例，其中男性65例，女性80例，年齡22～85歲，平均55歲，常規采用TCT檢測和DNA?ICM檢測。

1.2 儀器和試劑

LBP液基沉降式染色機及漿膜腔積液專用耗材（廣州安必平醫療科技有限公司），全自動細胞DNA圖像定量分析系統、細胞保存液以及相關制片試劑（廈門麥克奧迪醫療診斷有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 TCT檢測方法

將腹腔積液標本置于離心管中，加枸櫞酸鈉抗凝，以3 000 rpm/min的轉速離心5 min，棄上清液，置混合器上震蕩30 s，往離心管中加入12 mL細胞保存液，靜置5 min，棄置上清液：用吸管吸取細胞清洗液至5 mL，將標本混勻后，置漩渦混合器上震蕩30 s，涂4張片，95％乙醇固定10 min，2張常規蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin?eosin staining，HE）染色，封片，行細胞鏡檢，由我科2位資深病理醫師閱片，鏡下見炎性細胞判讀為陰性，鏡下見核異型細胞或腫瘤細胞判讀為陽性。

1.3.2 DNA?ICM檢測方法

將剩余2張薄層細胞片進行Feulgen染色，然后在全自動細胞DNA圖像定量分析系統，進行掃描處理，該系統由MoticBA6.0全自動數碼顯微鏡、DELL370工作站、MoticamPro205C攝像頭及自動顯微鏡控制盒等組成，系統對全片所有細胞核進行掃描測定，標本染色質量控制采用標準片作對照。根據系統診斷軟件所做的細胞DNA倍體分析，結果和建議有如下3種情況：正常細胞的DNA指數（DNA Index，DI）為1，即為二倍體細胞（2C），無異倍體細胞和異常細胞峰。4C細胞數大于被檢測細胞總數的5％，但無異倍體細胞診斷為增生。有3個以上DI＞2.5的細胞或有異倍體細胞峰診斷為陽性［4?5］。

1.4 統計學分析

以活檢病理組織診斷為標準，分別計算出TCT檢測和DNA?ICM檢測的敏感性和特異性。然后采用SPSS 17.0軟件進行數據處理，用Logistic回歸分析篩選變量并建立回歸方程，對新變量及單項指標進行ROC曲線分析。

2 結果

2.1 TCT檢測與DNA?ICM檢測對比

145例腹腔積液標本中TCT檢測37例陽性，DNA?ICM檢測48例陽性，其中48例出現3個或3個以上DI≥2.5的異倍體細胞或異倍體細胞峰，12例出現1～2個DI≥2.5的異倍體細胞。TCT檢測查見癌或疑癌細胞37例患者標本中，檢測有37例均出現DI≥2.5的異倍體細胞。TCT檢查見少數異型細胞的10例標本中，DNA?ICM檢測有8例出DI≥2.5的異倍體細胞。2例TCT檢查為陽性而DNA?ICM檢測為陰性。93例良性腹水中，TCT檢測有8例出現假陽性，而DNA?ICM檢測全部陰性。2種檢查方法結果比較，DNA?ICM檢測的陽性檢出率明顯高于TCT檢測方法，見表1、圖1～3。

表1145 例良惡性腹腔積液DNA?ICM檢測與TCT檢測診斷結果（n）Table 1145 cases of benign and malignant ascites by DNA?ICM and TCT diagnosis（n）

圖1 惡性腹腔積液患者液基細胞學檢測陽性結果（HE，×200）Figure 1The positive results of TCT in patients with malig?nant peritoneal effusion（HE，×200）

圖2 良性腹腔積液患者細胞DNA倍體檢查Figure 2Benign peritoneal effusion in patients with cell DNA times physical examination

2.2 TCT和DNA?ICM檢測與組織病理學比較

58例患者獲得活檢組織病理診斷結果，其中為惡性腫瘤患者39例，14例為卵巢癌，18例為胃腸道惡性腫瘤，4例為肝癌，3例為其他腫瘤。良性患者為19例，TCT檢測、DNA?ICM檢測與組織病理診斷比較，TCT檢測和DNA?ICM檢測敏感性分別為84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特異性分別為65％（13/20）和85％（17/20）結果見表2。二者兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.01）。與此同時，對TCT檢測、DNA?ICM檢測及2種方法聯合檢測用Logistic回歸生成的新變量（即預測概率）作ROC曲線分析，2種方法聯合診斷惡性腹腔積液的ROC曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC）為0.94，高于2種單項檢測的AUC，分別為0.90、0.75。即對惡性腹腔積液診斷能力評價ROC曲線下面積2種方法聯合＞DNA?ICM＞TCT，AUC越大，診斷能力則越強，見圖4。

圖3 惡性腹腔積液患者細胞DNA倍體檢查Figure 3Malignant peritoneal effusion in patients with DNA times physical examination

表2 TCT檢測、DNA?ICM與組織病理診斷比較Table 2Comparison of TCT，DNA?ICM and histopathology

3 討論

惡性腹腔積液是臨床的常見癥狀，對于它的診斷也一直是臨床面臨的難題，目前有很多的檢驗方法及指標判斷其良惡性，但各有利弊，如：脫落細胞學、腫瘤標志物、微小RNA含量檢測、DNA?ICM檢測、流式細胞術等［6?8］。但臨床上我們常以細胞學檢測為主。由于受細胞變異、蛻變以及主觀因素的影響，臨床的診斷率不高。因此提高惡性腹腔積液檢測的敏感性和特異性一直是臨床上迫切解決的問題。惡性腹腔積液主要可分為2類：一類是中央性腹水，系靜脈或淋巴管堵塞所致，常多見于卵巢癌、肝癌等；一類是周圍性腹水，由散布于腹膜表面的腫瘤結節分泌某些介素，導致腹膜毛細血管通透性增加所致，是晚期腫瘤患者產生腹水的主要原因。在臨床上常規抽取腹水送細胞學檢查，往往由于腹水惡性腫瘤細胞量少等原因檢測陽性率不高，且由于間皮細胞和巨噬細胞的干擾，有時會出現假陽性。

圖4 TCT檢測、DNA?ICM檢測及2種方法聯合檢測的ROC曲線分析Figure 4ROC curve analysis TCT，DNA?ICM and two kinds of methods combination for detection

TCT檢測是一項制片技術，它發展于20世紀90年代。最初用于宮頸細胞學檢查，隨著病理學的不斷發展，其在胸腹腔積液等非婦科領域也得到了運用。它具有簡捷方便、快速經濟、特異性高的特點，但是由于技術操作及涂片受主觀影響較大，使其存在敏感性低、假陰性率高的缺點。與傳統的普通制片方法相比較，TCT檢測改善了樣本的收集方法，除去了紅細胞、粘液及炎性滲出物，能使細胞均勻完整地分布在載玻片上，同時也保全了細胞的抗原生物特性，有利于腫瘤細胞的鑒別診斷。細胞DNA?ICM檢測是我國近幾年迅速發展起來的一項新型技術，在診斷細胞學良惡性方面它有著不可替代的優越性，它是從細胞DNA的水平方面進行分析，并以點陣分布圖和直方圖形式描繪細胞中非整倍體細胞的個數。

對于惡性腹腔積液的診斷率，國內外相關文獻報道顯示，TCT檢查對惡性腹水診斷的敏感度為81.4％，特異性為90.4％，DNA?ICM檢測惡性腹腔積液敏感性為88.3％，特異性為100％［2?3］。本文也對此2種方法進行比較分析，并加以單項檢測與聯合檢測作ROC曲線作對比分析。145例腹腔積液標本中TCT檢測和DNA?ICM檢測敏感性分別為84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特異性分別為65％（13/20）和85％（17/20）。對TCT檢測、DNA?ICM檢測及2種方法聯合檢測用Logistic回歸生成的新變量（即預測概率）作ROC曲線分析，對惡性腹腔積液診斷能力評價ROC曲線下面積2種方法聯合＞DNA?ICM＞TCT，ROC曲線下面積越大，診斷能力則越強。與相關研究對比，本文2種方法對惡性腹腔積液診斷的敏感性與特異性稍有降低，其一可能受病理醫師閱片主觀所影響，其二與制片的操作技術有關，其三對是否為惡性腹腔積液的評定標準有關。因此，由以上可得出DNA?ICM檢測的敏感性和特異性明顯高于TCT檢測。而將2種方法相結合，可以很大程度地降低惡性腹腔積液的誤診率和漏診率，即可很大地提高對惡性腹腔積液的診斷準確性。同時研究顯示惡性腹腔積液中，TCT檢測陽性的37例標本中，DNA?ICM檢測2例為陰性，可能因為DNA?ICM只能對DNA倍體已經發生改變的腫瘤細胞做出診斷，對DNA倍體未發生改變的二倍體腫瘤細胞檢測呈假陰性。這可能是由于細胞在發生癌變的過程中，細胞核DNA的含量和結構的變化先于細胞形態的改變。本研究發現DNA?ICM檢測的敏感度、特異度高于TCT的敏感度、特異度，檢測效果優于TCT檢測。DNA?ICM通過全自動數碼顯微鏡進行閱片，仔細掃描每一個視野，降低了漏檢的可能，提高了檢測的敏感度。通過圖像分析系統自主分析，測出每一個細胞DNA含量的具體數值，客觀準確，提高了檢測的特異度和準確度［6?7］。

由此可見，單純的依靠DNA?ICM檢測或TCT檢測的測定，很難對腹腔積液進行精確診斷。將二者聯合起來檢測，能最大程度上提高惡性腹腔積液診斷的靈敏性及特異性，是目前值得推廣的診斷腹腔積液的方法。

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The diagnostic value of DNA image cytometer and thinprep cytologic test for malignant peritoneal effusion

HUANG Liuyan1，LIU Chongmei2★，MAO Min2，ZOU Ya2，YANG Juan1，ZHANG Xuechun1
（1.Graduate School of University of South China，Hengyang，Hunan，China，421001；2.Department of Pa?thology，Yueyang Second People’s Hospital，Yueyang，Hunan，China，414000）

ObjectiveTo study the application of DNA image cytometer(DNA?ICM)and thinprep cytologic test(TCT)for the diagnosis of malignant peritoneal effusion.MethodsWe collected the ascites of 145 patients in the second people's hospital of Yueyang from August 2013 to August 2015.All ascites sample were detected by DNA?ICM and TCT,their sensitivity and specificity were then compared.Utilizing applied logistic regression,receiver operating characteristic(ROC)curve was plotted and the area under ROC curve(AUC)was calculated to assess the diagnostic value of each index.ResultsThe positive detection rate of malignant cells in ascites by DNA?ICM was higher than by TCT,the difference between the two methods was significant(P＜0.05).The sensitivity of TCT diagnosis of malignant ascites was 84.21％, specificity was 65％(P＜0.05).The sensitivity of DNA?ICM diagnosis of malignant ascites was 94.74％, specificity was 85％(P＜0.05).The AUC of the combined examination of DNA?ICM and TCT for malignant peritoneal effusion was 0.94,higher than the AUC of DNA?ICM and TCT single index examinations,which was 0.90 and 0.75 respectively.ConclusionsCompared with thinprep cytologic test,DNA quantitative analysis has a higher sensitivity and specificity.We can greatly improve the accuracy of diagnosis of malignant ascites with a combination of the two methods.

DNA image cytometer；Thinprep cytologic test；Peritoneal effusion

湖南省科技廳科技資助項目（2014SK3144）；南華大學研究生創新科研項目（2014×C×35）

1.南華大學研究生院，湖南，衡陽421001 2.岳陽市二人民醫院病理科,湖南，岳陽414000

★通訊作者：劉崇梅，E?mail：2279700843@qq.com