殼聚糖沒食子酸衍生物酶法催化條件優化及抗氧化活性和細胞毒性

吳 昊，王藝穎，甄天元，羅 丹，張 瀟，楊紹蘭，王成榮*

殼聚糖沒食子酸衍生物酶法催化條件優化及抗氧化活性和細胞毒性

吳 昊，王藝穎，甄天元，羅 丹，張 瀟，楊紹蘭，王成榮*

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

利用漆酶、辣根過氧化物酶在均相和非均相反應體系中催化殼聚糖與沒食子酸反應，以增強殼聚糖的抗氧化性。研究酶種類、反應體系pH值、反應溫度、反應時間、酶用量和底物的質量比等因素對產物接枝率的影響。利用單因素試驗和正交試驗確定的最適反應條件為反應pH 4.5、反應溫度25 ℃、反應時間5 h、沒食子酸與殼聚糖的質量比3∶1、漆酶用量4 U，此條件下衍生物的接枝率為65.2%。對衍生物分別進行體外抗氧化活性和細胞毒性檢測，結果表明，在相同添加量的情況下，衍生物的抗氧化性顯著高于未改性的殼聚糖，而且產物無細胞毒性。

酶；殼聚糖沒食子酸衍生物；抗氧化；細胞毒性

殼聚糖（chitosan，CTS）是甲殼素脫乙酰基后得到的一種無毒的、生物可降解多糖，廣泛應用于食品工業、醫藥、化妝品和廢水處理等方面[1]。CTS的抗氧化能力主要來自于氨基上N的螯合能力以及氨基和羥基較弱的給電子能力，被稱為次級型抗氧化劑[2]。由于CTS僅能溶于稀酸，故限制了CTS的應用，因此，對CTS進行改性，在提高其溶解度的同時賦予其新的特性，已成為研究開發CTS應用的方向之一[3]。

沒食子酸（gallic acid，GA）是一種從植物（特別是綠茶）中提取的天然酚類抗氧化劑，具有較強的清除自由基和抗氧化作用，GA作為初始型抗氧化劑，可以很好地提供氫原子或電子以抑制氧化鏈的反應[4]，但是GA作為小分子抗氧化劑的穩定性較差，在高溫、光照等條件下易分解。有效的方法是將這些小分子共價結合到配體上，以增強它的穩定性[5]。已有研究者采用化學方法將其結合到CTS分子上來增強CTS的抗氧化性[6-7]和GA的穩定性，但化學方法存在著反應步驟多、專一性差等特點，隨著人們環保意識的增強，作為綠色化學研究的一個重要部分，生物催化劑酶用于高分子的合成及改性正成為一個新的研究熱點。

漆酶（EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，在果汁加工、生物漂白、物質合成和廢水處理等方面被廣泛應用，它利用銅離子特有的氧化還原能力氧化酚類和芳香類化合物，利用自由基反應機理完成4 個電子的轉移，同時將分子氧還原成水[8]。酚類化合物是典型的漆酶底物，它的氧化還原電勢較低，可以允許電子傳遞給Cu（Ⅰ），反應過程中，酚被氧化成苯氧自由基，根據反應條件的不同，可以進一步通過自由基偶合反應發生聚合或重排生成苯醌。漆酶可以使酚型結構單元失去一個電子形成酚氧游離基，進而形成醌型結構[9]，醌可以與CTS上的氨基基團產生化學鍵連接，目前普遍認為醌與氨基通過席夫堿或邁克爾加成反應機理發生共價作用。

辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）是應用較廣泛的一種酶制劑，是一種含鐵卟啉輔基的糖蛋白復合酶[10]，對底物具有光譜選擇性，能催化氧化漆酶所不能催化的一元酚和一元胺[11]且具有特殊的催化效果，在H2O2的存在下，能夠使苯胺類物質或酚類的單體發生聚合反應，在單體氨基、羥基的鄰、對位發生交聯[12]。在酶促反應中通常把過氧化氫作為HRP的底物，在有供氫體存在時，二者反應快且專一，被視作理想的催化組合。HRP易于提取、價格低廉、性能穩定、耐熱性好且活性很少受損失，因此適于催化CTS與GA的聚合。

本實驗以CTS和GA為原料，利用漆酶與HRP為催化劑催化二者合成，通過單因素試驗和正交試驗考察最適反應條件，以接枝率和溶解度為考察指標得出最適酶種類和反應方法，并在此基礎上對產物的體外抗氧化活性和細胞毒性進行研究，旨在為CTS-GA衍生物的酶法制備和應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CTS（脫乙酰度為90.8%） 青島云宙生物科技有限公司；GA 天津市科密歐化學試劑有限公司；漆酶（由米曲霉制得，酶活力1 000 U/g）、HRP（酶活力300 U/mg） Solarbio專業分子試劑生產商；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AR 2140電子分析天平（萬分位） 奧豪斯國際商貿有限公司；81-2恒溫磁力攪拌器 國華電器有限公司；pH計 瑞士Mettler Toledo公司；真空循環水式真空泵 鄭州科工貿有限公司；真空冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；Elx808型自動酶標儀 美國Bio-Tek公司；MCO-18AIC型CO2培養箱 日本Sanyo公司；CKX-41型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；SW-CJ-1FD型單人單面超凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 接枝率的測定

用線性電位滴定法[13]測定CTS自由氨基含量，按下式計算接枝率：

式中：D0為接枝前CTS的自由氨基含量；D1為接枝后CTS-GA衍生物的自由氨基含量；D為未處理CTS的自由氨基含量。

1.3.2 接枝反應酶和方法的選擇

1.3.2.1 均相方法

將1.0 g CTS粉末溶于100 mL pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，攪拌至完全溶解后按質量比3∶1的量加入GA，繼續攪拌，溶解完全后分別加入同等酶活的漆酶和HRP，于25 ℃氣浴搖床中反應8 h，反應完成后加無水乙醇醇沉24 h，抽濾，將產物溶于超純水中，透析24 h，每隔8 h換一次水，冷凍干燥后得CTS-GA衍生物。

1.3.2.2 非均相方法

取一定質量的CTS薄膜溶于pH 6.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，按質量比為3∶1的量加入GA，攪拌均勻后加入同等酶活的漆酶和HRP，于25 ℃氣浴搖床中反應8 h，反應結束后將CTS-GA膜取出烘干至質量恒定。

1.3.3 溶解度測定

取20 mg干燥至質量恒定的CTS-GA溶解于50 mL蒸餾水中，氣浴搖床中振蕩溶解24 h，目測溶解情況，將不溶解的樣品過濾干燥后稱量質量，比較前后質量差，計算溶解度。

1.3.4 單因素試驗

接枝反應方法和酶種類確定后，測定制備得到的CTS-GA接枝率。固定其他條件，分別考察反應pH（2.7～4.5）、反應時間（1～8 h）、反應溫度（25～55 ℃）、漆酶用量（1～20 U）和GA與CTS的質量比（1∶1～6∶1）對接枝率的影響。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，為了獲得制備CTS-GA的最適條件，利用正交試驗法，以反應時間、反應溫度、漆酶用量和GA與CTS質量比（GA/CTS）為4 個考察因素，選取3 個水平進行試驗。采用L9（34）正交表進行正交試驗設計，確定反應的最適條件。因素水平設計見表1，每組試驗重復3 次。

表1 正交試驗因素與水平Table1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.6 DPPH自由基清除能力測定

參照楊娜等[14]的方法測定。

1.3.7 羥自由基（·OH）清除能力測定

參照朱慶麟等[15]的方法，采用水楊酸法。

1.3.8 超氧陰離子自由基（O2－·）清除能力測定

參照趙強忠等[16]的方法，采用鄰苯三酚自氧化法。

1.3.9 細胞毒性實驗

參照張林樸等[17]的方法，采用MTT比色法檢測，實驗所用細胞為大鼠成纖維細胞。用酶標儀檢測樣本孔的吸光度A，計算各組在490 nm波長吸光度，計算相對增殖率后，按表2所列標準評價其細胞毒性。

表2 細胞毒性評價標準Table2 Criteria for cytotoxicity evaluation

1.4 數據處理

實驗數據為3 次實驗的平均值，采用Origin 8.5繪圖，SPSS 19.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 接枝反應酶種類及方法的確定

表3 不同酶種類及反應方法對CTS-GA接枝率和溶解度的影響Tabel 3 Effect of different types of enzymes and different grafting methods on grafting ratio and solubility of CTS-GA

由表3可以看出，利用漆酶催化反應，采用均相方法可以使CTS獲得較高的接枝率。采用非均相方法制備的CTS-GA接枝率低于均相方法，HRP的最適pH 6.0左右，因此采用HRP催化反應時適宜采用非均相方法，但非均相制備得到的衍生物溶解度并不理想。有研究表明，CTS在均相條件下脫乙酰，當CTS的自由氨基脫去50%左右時，產物具有良好的水溶性，但如果反應在非均相的條件下進行，不論其脫乙酰度如何，都不溶于水[18-19]。本實驗中酶種類和合成方法對接枝率和溶解度的影響差異顯著，因此，該實驗采用均相方法來合成CTS-GA，使用漆酶來催化該反應。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 反應pH值對接枝率的影響

圖1 pH值對衍生物接枝率的影響Fig. 1 Influence of initial reaction pH on grafting ratio of derivatives

從圖1可以看出，pH值小于3.0時，CTS-GA的接枝率小于40%，隨著酸性的逐漸減弱，CTS-GA接枝率逐漸升高，當pH值在3.7～4.5范圍內，接枝率保持穩定，維持在50%～55%之間，無顯著性差異。隨著pH值的增大，CTS溶解度下降。當pH值在3.7～4.5范圍內時，可使CTS-GA獲得較高的接枝率，這與漆酶在pH 4.5附近具有較高活性的性質是一致的[20]。綜合考慮接枝率與漆酶最適pH值范圍，后續正交試驗中并不把pH值作為考察因素，直接選用4.5為最佳反應pH值。

2.2.2 反應溫度對接枝率的影響

圖2 溫度對衍生物接枝率的影響Fig. 2 Influence of reaction temperature on grafting ratio of derivatives

漆酶的最適反應溫度較低，一般在25～50 ℃之間，從圖2可以看出，在室溫（25 ℃）條件下，CTS-GA的接枝率為58%，隨著溫度的逐漸升高，接枝率隨之升高，在30 ℃時達到最高值（63.5%），但當溫度繼續升高時，接枝率出現逐漸下降的趨勢，這可能是由于溫度升高，漆酶催化活性提高，等量漆酶能催化更多GA產生自由基，并增加GA上酚氧自由基與CTS鏈的接觸幾率，所以溫度升高有利于提高接枝率。但溫度過高，影響漆酶活力，接枝率降低。同時由于CTS的接枝反應是加成和解聚反應的可逆過程，當溫度達到30 ℃時，由于加成反應速率小于解聚反應速率，接枝率反而有所下降。因此，30 ℃是漆酶催化CTS與GA反應的最適溫度。

2.2.3 漆酶用量對接枝率的影響

圖3 漆酶用量對衍生物接枝率的影響Fig. 3 Influence of enzyme dosage on grafting ratio of derivatives

從圖3可以看出，隨著漆酶用量的增加，接枝率呈先上升后下降的趨勢，當漆酶用量達到4 U后，CTS-GA的接枝率逐漸下降，這可能是由于催化氧化GA的反應速率加快，反應中間產物還未充分與CTS上氨基反應完全就自身發生聚合反應引起接枝率下降。在該反應體系中，當漆酶用量為4 U時，可使CTS-GA的接枝率達到最高（60.3%）。

2.2.4 反應時間對接枝率的影響

圖4 反應時間對衍生物接枝率的影響Fig. 4 Influence of reaction time on grafting ratio of derivatives

從圖4可以看出，隨著反應時間的延長，CTSGA接枝率呈先上升后下降的趨勢，在4 h達到最高值（63.4%），隨著時間的延長，接枝率逐漸降低。反應前期，隨著反應時間的延長，CTS-GA的接枝率逐漸增加，CTS-GA達到一定濃度后，會抑制正反應的進行，使逆反應的速率增加，最終反應逐漸趨于平衡。

2.2.5 GA/CTS對接枝率的影響

從圖5可以看出，當GA/CTS為3∶1時，接枝率最大。當GA的質量濃度較低時，CTS分子中的氨基位點多于GA分子的數量，使得CTS并不能全部參與反應，進而導致CTS-GA接枝率降低。隨著反應體系中GA質量濃度的不斷增加，有利于GA酚氧自由基的生成，但由于CTS接枝位點數量有限，GA/CTS大于3∶1時，接枝率趨于平衡。當GA質量濃度繼續增加時，過量的GA使漆酶催化氧化GA速率加快，反應中間產物未充分與CTS上的氨基反應完全就自身發生聚合反應引起接枝率下降。因此，當GA/CTS為3∶1時，可達到最高接枝率。

圖5 GA 5 GA/CTS對衍生物接枝率的影響Fig. 5 Influence of GA-to-CTS ratio on grafting ratio of derivatives

2.3 正交試驗結果及數據分析

表4 正交試驗設計及結果Table4 Orthogonal array design with experimental results

如表4所示，在所選試驗范圍內，各因素對接枝率的影響主次為C（反應時間）＞B（漆酶用量）＞D（GA/CTS）＞A（反應溫度）。由正交試驗結果得出，反應溫度25 ℃、漆酶用量4 U、反應時間5 h、GA/CTS 3∶1是合成CTS-GA的最適條件。

2.4 CTS-GA抗氧化活性

2.4.1 清除DPPH自由基的能力

如圖6所示，CTS對DPPH自由基的清除率最高不超過30%，原因是CTS給電子能力較弱，屬于次級抗氧化劑，以及CTS分子間和分子內氫鍵抑制了對自由基的清除，而CTS-GA在很小質量濃度變化范圍內對DPPH自由基清除作用顯著提高，6.5 μg/mL時對DPPH自由基的清除率高達90%。CTS-GA和GA對DPPH自由基清除率的IC50值分別為1.45 μg/mL和1.39 μg/mL，二者IC50值顯著低于未改性CTS，并且CTS-GA對DPPH自由基的清除效果優于GA，這可能是由于改性后的CTS-GA活性羥基增多，能提供更多質子與DPPH自由基結合生成穩態的DPPH2

[21]，進而有效地清除了DPPH自由基，因此，通過GA改性CTS制備的CTS-GA抗氧化能力得到顯著提高。

圖6 CTS、GA和衍生物清除DPPH自由基能力Fig. 6 DPPH scavenging capacity of CTS, GA and CTS-GA

2.4.2 清除·OH能力

圖7 CTS、GA和衍生物清除?OH能力Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging capacity of CTS, GA and CTS-GA

由圖7可以看出，CTS由于自身結構等原因具備極低的清除·OH的能力，在質量濃度為250 μg/mL時，CTS對?OH的清除率僅為19.1%，而GA和CTS-GA對?OH的清除率分別高達54.5%和78.6%。各樣品對?OH的清除能力隨質量濃度的增大而增加，其中CTS-GA最為明顯。CTS-GA之所以具備較高的清除?OH能力，可能是由于CTS-GA含有較多的羥基（一部分是CTS本身存在的羥基，另一部分是經GA改性后新引入的羥基），羥基的氫原子可以與?OH發生奪氫反應從而起到清除?OH的作用[22]。

CTS中存在伯、仲羥基、—NH2，可與·發生反應，清除·，由于高分子CTS含較多氫鍵，結構緊密，使得CTS中的活性官能團與·作用的幾率降低[23]。而CTS與GA反應生成CTS-GA后，雖然相應的—NH2位點減少，但由于GA的加入引入了更多的—OH，更易與充分作用，因此，清除·能力增強。從圖8可以看出，CTS-GA清除·效果顯著優于CTS，但與GA相比，差異不顯著，GA已被證實在體外具有較強的抗氧化作用，因此，CTS-GA也可作為一種有效的抗氧化劑[24]。

圖8 CTS、GA和衍生物清除?能力Fig. 8 Superoxide anion radical scavenging capacity of CTS, GA and CTS-GA

2.5 細胞毒性檢驗結果

表5 CTS、GA和CTS-GA細胞毒性結果Table5 Cytotoxicity of CTS, GA and CTS-GA

MTT比色法檢測CTS-GA細胞毒性結果見表5。在低質量濃度（10 μg/mL）時CTS、GA和CTS-GA細胞增殖率均大于100%，毒性級別為0級，當質量濃度范圍在500～1 000 μg/mL時，CTS-GA毒性級別顯著低于CTS。這一結果表明，采用GA對CTS進行適當改性后，CTSGA細胞毒性明顯降低，CTS-GA有可能成為一類用途更為廣泛、安全無毒的抗氧化劑。

3 結 論

采用均相方法合成CTS-GA，最適反應條件為pH 4.5、反應溫度25 ℃、漆酶用量4 U、反應時間5 h，GA/CTS 3∶1，此條件下CTS-GA的接枝率為65.2%。CTS經過GA改性生成CTS-GA后，抗氧化能力明顯提高；在500～1 000 μg/mL質量濃度范圍內，CTS-GA的毒性明顯低于CTS，屬安全范圍。

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Optimization of Enzymatic Reaction between Chitosan and Gallic Acid for Enhanced Antioxidative Activity and Reduced Cytotoxicity

WU Hao, WANG Yiying, ZHEN Tianyuan, LUO Dan, ZHANG Xiao, YANG Shaolan, WANG Chengrong*
(College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

In this paper, chitosan (CTS) grafted copolymer with gallic acid (GA) was synthesized by laccase and horse radish peroxidase to enhance the antioxidant activity of chitosan. The effects of enzyme type and dosage, initial reaction pH, temperature, reaction time, and enzyme-to-substrate ratio on the grafting ratio were studied. The maximum grafting ratio (65.2%) was obtained when the reaction took place at 25 ℃ for 5 h in 100 mL of acetate buffer solution (100 mmol/L) at pH 4.5 with a mass ratio of GA to CTS of 3 in the presence of 4 U of laccase under constant stirring. At the same dosage, the CTSGA copolymer showed signif cantly higher antioxidant activity than chitosan and had no cytotoxicity.

enzyme; derivative from chitosan and gallic acid; antioxidant; cytotoxicity

10.7506/spkx1002-6630-201702036

TS202.3

A

1002-6630（2017）02-0227-06

吳昊, 王藝穎, 甄天元, 等. 殼聚糖沒食子酸衍生物酶法催化條件優化及抗氧化活性和細胞毒性[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 227-232. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702036. http://www.spkx.net.cn

WU Hao, WANG Yiying, ZHEN Tianyuan, et al. Optimization of enzymatic reaction between chitosan and gallic acid for enhanced antioxidative activity and reduced cytotoxicity[J]. Food Science, 2017, 38(2): 227-232. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702036. http://www.spkx.net.cn

2016-05-20

山東省現代農業（蔬菜）產業技術體系建設項目（SDAIT-05-21）；山東省農業重大應用技術創新項目（SDNYCX-2015-ZD06-02）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31401549）；山東省高等學校科技計劃項目（J14LE11）；青島市科技計劃項目（14-2-4-71-jch）；青島農業大學高層次人才科研基金項目（1207）

吳昊（1981—），女，副教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：wuhaoqau@163.com

*通信作者：王成榮（1958—），男，教授，碩士，研究方向為農產品貯藏與加工、食品科學。E-mail：qauwcr@126.com