自噬在血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞遷移和增殖的作用

侯祥平，陳柳丹，林玉潔，陳克芳，麥華超，陳 珂，李建軍

自噬在血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞遷移和增殖的作用

侯祥平，陳柳丹，林玉潔，陳克芳，麥華超，陳 珂，李建軍

目的 探討自噬對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的血管平滑肌細胞(VSMCs)遷移和增殖的影響。方法 采用體外培養大鼠胸主動脈VSMCs，采用不同濃度AngⅡ(10-10mol/L～10-6mol/L)刺激VSMCs 24 h，免疫印跡檢測細胞自噬標志物LC3、Beclin1的表達；采用最佳濃度AngⅡ(10-7mol/L)對VSMCs刺激不同時間點(0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)，同時檢測LC3、Beclin1表達。采用AngⅡ1型受體阻斷劑(洛沙坦鉀)、AngⅡ型受體阻斷劑(PD123319)進行預孵，之后采用最佳濃度AngⅡ刺激，檢測LC3表達。采用自噬特異性阻斷劑3-MA進行預孵，通過損傷愈合試驗，CCK8增殖試驗檢測細胞自噬在AngⅡ誘導的VSMCs遷移和增殖的作用。結果 AngⅡ刺激可引起VSMCs發生自噬，表現為LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1上調，且呈現明顯時間、劑量效應(P<0.05)，10-7mol/L AngⅡ刺激24 h自噬最強。AngⅡ1型受體(AT1)阻滯劑(洛沙坦鉀)能抑制AngⅡ誘導VSMCs的自噬(P<0.05)，而AngⅡ2型受體(AT2R)阻滯劑(PD123319)不能抑制AngⅡ誘導VSMCs自噬(P>0.05)。自噬特異性阻斷劑3-MA能抑制AngⅡ誘導VSMCs的遷移和增殖。結論 AngⅡ可通過AT1R誘導VSMCs發生自噬，從而促進VSMCs遷移和增殖。

血管緊張素Ⅱ；自噬；血管平滑肌細胞；遷移；增殖

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是臨床常見疾病，是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎，其發病機制尚未完全清楚，臨床無特異性藥物治療[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖與遷移的異常是引起AS的重要因素[2]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作為腎素-血管緊張素系統(RAS)的主要效應分子可誘導多種炎癥因子，促進VSMCs增殖和遷移[3-4]，參與AS的發生和發展過程。選擇性血管緊張素-1型受體(AT1)拮抗劑通過阻斷AngⅡ與AT1受體結合產生的一系列生物學活性物質，從而抑制AS形成和發展[3]。近年來，自噬在心血管疾病方面研究取得進展。目前研究更多關注自噬與心肌肥厚、心室重構、心肌缺血/再灌注損傷的關系，而在自噬調控血管組成細胞的增殖、分化和轉歸研究甚少[5-6]。

本研究探討自噬在AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞遷移和增殖的作用，為探究AngⅡ治療相關血管疾病提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)單克隆抗體(福建邁新生物技術公司)，AngⅡ(Sigma)，PD123319(Sigma)，兔抗人輕鏈3(LC3)多克隆抗體(美國Sigma)，兔抗人Beclin-1多克隆抗體，兔抗人β-actin多克隆抗體(美國SantaCrus)，3-甲基腺嘌呤(3-MA)(Sigma)，CCK-8試劑盒(碧云天)，增殖細胞核抗原(PCNA)、趨化用微孔濾膜(孔徑8 μm，Sigma)。

1.2 大鼠培養及鑒定 健康Wistar大鼠，體重150 g～180 g，斷頸法處死后，無菌條件下迅速取下主動脈，游離動脈中層，采用組織貼壁法培養VSMCs。細胞呈VSMCs特征性“峰”“谷”狀生長，特異性鼠抗人α-SM-actin免疫組織化學染色證實為VSMCs。實驗用生長旺盛的2代～5代VSMCs。

1.3 實驗分組 將血管平滑肌細胞隨機分組，AngⅡ刺激組：不同濃度AngⅡ(0 mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L)刺激VSMCs 24 h；AngⅡ刺激細胞不同時間組：10-7mol/L AngⅡ分別刺激VSMCs 0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h；3-MA組：5 mmol/L 3-MA預孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h；洛沙坦鉀+AngⅡ組：洛沙坦鉀預孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h；PD123319+AngⅡ組：10-7mol/L PD123319預孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h。

1.4 自噬標志蛋白(LC3、Beclin-1)表達 采用Western blotting法檢測LC3、Beclin-1的表達，各組細胞棄去培養基，預冷的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗滌細胞2次，每組細胞加入100 lRIPA裂解液(碧云天)(含1 mmol/L苯甲基磺酰氟)，冰上裂解30 min，4 ℃預冷離心機12 000 r/min離心5 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃變性5 min每組取30 g蛋白上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，200 mA，30 min將蛋白電轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(LC3B 1∶1000，Beclin-1 1∶500， β-actin 1∶500)4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗(HRP標記山羊抗兔IgG 1∶1000)室溫孵育1 h，洗滌緩(TBST)洗膜3次，每次5 min，發光液(ECL)顯影，凝膠成像系統掃描分析，結果以目的蛋白/內參的灰度比值表示。

1.5 增殖試驗 制備實驗所需細胞懸液：細胞計數，接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約100 μL細胞懸液，同樣樣本做3個重復。37 ℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養2 h～4 h。加入10 μL CCK8：由于每孔加入CCK8量較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或直接配置含10%CCK8的培養基，以換液形式加入。培養1 h～4 h：細胞種類不同，形成的Formazan量也不一樣。若顯色不夠，可繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成Formazan很少，需要較長顯色時間(5 h～6 h)。測定450 nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450 nm～490 nm，參比波長600 nm～650 nm。

1.6 遷移試驗 細胞生長至80%融匯時減少胎牛血清濃度為0.4%繼續培養48 h，使VSMCs生長靜止。相應組別用3-MA預處理60 min后將細胞懸液(6×108個/L)加入上室，按不同組別分別與下室中加入AngⅡ、3-MA(總濃度2.4×108個/L)。37 ℃培養6 h后取出濾膜，固定，蘇木素染色，鏡下計數濾膜下層的細胞(×400)。每張濾膜由同一操作者鏡下計數5個相鄰視野，相同來源VSMCs制作成4張獨立濾膜，均值代表遷移的細胞數(cells/HPF)。不同來源細胞系重復3次。

2 結 果

2.1 AngⅡ誘導VSMCsLC3的表達 采用不同濃度(10-10mol/L～10-6mol/L)AngⅡ分別干預VSMCs 24 h后，通過Western blotting測定自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的變化。在一定范圍內隨著劑量增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達增加(詳見圖1A)。在10-7mol/L濃度時達到峰值，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)(詳見圖1B)。以10-7mol/L AngⅡ為固定濃度刺激血管平滑肌細胞，隨著刺激時間延長，LC3-Ⅱ表達逐漸增強(詳見圖1C)，在24 h達到峰值，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)(詳見圖1D)。

圖1 AngⅡ誘導VSMCsLC3的表達

2.2 AngⅡ誘導VSMCs Beclin-1的表達 以10-7mol/LAngⅡ為固定濃度刺激血管平滑肌細胞，隨著刺激時間延長，LC3-Ⅱ表達逐漸增強(詳見圖2A)，24 h達到峰值，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)(詳見圖2B)。

圖2 AngⅡ誘導血管平滑肌細胞Beclin-1蛋白的表達

2.3 AngⅡ受體(ATIR、AT2R)對AngⅡ誘導VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達 采用AngⅡ 1型受體洛沙坦鉀(losartan)預孵育VSMCs 30 min，加入10-7mol/L AngⅡ刺激血管平滑肌細胞后，通過Western blotting法檢測自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達。結果顯示，AngⅡ可明顯增加VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(P<0.01)；AT1R拮抗劑洛沙坦鉀可降低AngⅡ誘導的VSMCs LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達，與AngⅡ刺激組比較，差異有統計學意義(P<0.01)(詳見圖3)；AT2R拮抗劑PD123319不可降低AngⅡ誘導的VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達，與AngⅡ刺激組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(詳見圖4)。研究表明，AngⅡ誘導ASMC的自噬是通過ATIR介導實現的。

2.4 自噬抑制劑(3-MA)在AngⅡ誘導VSMCs遷移與增殖中的作用 未經AngⅡ干預的VSMCs在基礎狀態下也存在著細胞遷移，但遷移細胞數量很少；給予AngⅡ10-7mol/L處理后顯著增加VSMCs跨膜遷移細胞數量(P<0.01)，用5 mmol/L 3-MA預孵育VSMCs，跨膜遷移細胞數量未見明顯增加(P>0.05)，隨后加入10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs 24 h后，與AngⅡ刺激組比較，3-MA抑制AngⅡ誘導血管平滑肌細胞跨膜遷移細胞的數量，遷移細胞顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)(詳見圖6)。同理，給予10-7mol/L AngⅡ處理后顯著增加VSMCs增殖細胞數量(P<0.01)，用5 mmol/L 3-MA預孵育VSMCs，增殖細胞數量未見明顯增加(P>0.05)，隨后加入10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs 24 h后，與AngⅡ刺激組比較，3-MA抑制AngⅡ誘導血管平滑肌細胞增殖細胞的數量，增殖細胞顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)(詳見圖7)。表明自噬存在于AngⅡ誘導VSMCs的遷移與增殖，且其自噬抑制劑對AngⅡ誘導VSMCs的遷移與增殖有抑制作用(詳見圖5)。

圖3 洛沙坦鉀對AngⅡ誘導VSMCs LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影響

圖4 PD123319對AngⅡ誘導VSMCsLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影響

圖5 蘇木素染色圖

圖6 3-MA在AngⅡ誘導VSMCs遷移的作用

圖7 3-MA在AngⅡ誘導VSMCs增殖的作用

3 討 論

自噬作為維持細胞內環境穩定的重要機制，通過對受損細胞器和老化蛋白質等大分子物質進行降解及再利用，為新蛋白質合成和細胞器更新提供原料，從而維持細胞內環境穩定，如選擇性地清除受損的可釋放促凋亡因子如細胞色素C的線粒體[7]，但過度自噬會導致自噬性程序性死亡增加。微管相關蛋白1LC3是公認的標記性自噬分子。在自噬發生過程中，LC3-Ⅰ被Atg7和Atg3在內的泛素樣體系修飾和加工，產生相對分子質量較小的LC3-Ⅱ，并定位到自噬小體中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ變化可用來判斷自噬是否被誘導[4]。Beclin-1基因是近十多年來發現與自噬相關的一種抑癌基因，其參與自噬，調節程序性細胞死亡，Beclin-1蛋白是研究自噬的另一個標志性蛋白。

VSMCs是構成血管壁的主要細胞成分之一[4，8]，在動脈粥樣硬化形成和發展過程中，VSMCs的增殖與分化起重要作用[9-11]。當出現高血壓、動脈粥樣硬化、再狹窄等多種血管損傷性疾病時，VSMCs從血管中膜向內膜遷移，并以自分泌、旁分泌形式分泌大量細胞因子和血管活性物質，故VSMCs遷移與增殖是血管病變的細胞基礎病理改變之一[12]。AngⅡ作為RAS主要效應分子。血管壁局部生成AngⅡ經血管平滑肌細胞上AngⅡ1型受體(AT1R)直接作用于血管平滑肌細胞，強烈表達生物活性，促進VSMCs增殖和遷移。

本研究發現AngⅡ干預血管平滑肌細胞后出現自噬標志物LC3-Ⅱ向LC3-Ⅰ轉化，并呈時間和濃度依賴性，24 h達最高峰，10-7mol/L濃度時達到峰值。Beclin-1在12 h表達上調，24 h達最高峰，提示AngⅡ誘導血管平滑肌細胞發生自噬。AngⅡ通過與細胞膜上特異性受體結合而發揮作用，在人體中以AT1R和AT2R為主，本研究發現AT1R拮抗劑洛沙坦鉀可降低AngⅡ誘導VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達，而AT2R則不能，表明AngⅡ誘導VSMCs自噬通過AT1R介導實現的。3-MA是P13K的抑制劑，被廣泛用作自噬的抑制劑，本研究發現應用3-MA可抑制AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞遷移與增殖，進一步表明自噬存在于AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞遷移與增殖，自噬抑制劑能抑制AngⅡ誘導VSMCs的遷移與增殖，其自噬可通過AT1R介導調節AngⅡ誘導VSMCs的遷移和增殖，為探究影響自噬藥物治療AngⅡ相關血管疾病提供新策略。

自噬對血管平滑肌細胞的作用是雙重的，既可能起到保護作用，又可能起到損傷作用。本課題是在體外細胞水平上研究自噬在血管平滑肌遷移和增殖的作用。本研究證實，AngⅡ可誘導血管平滑肌細胞自噬明顯增加，并與時間和濃度呈依賴性。自噬抑制劑3-MA對AngⅡ誘導的VSMCs遷移與增殖有抑制作用。提示自噬可能是AngⅡ誘導VSMCs遷移與增殖的一個作用環節，可能通過調節自噬水平影響動脈粥樣硬化的發生發展，其具體分子機制仍需進一步研究和探索。

[1] 劉俊田.動脈粥樣硬化發病的炎癥機制的研究進展[J].西安交通大學學報(醫學版)，2015(2)：141-152.

[2] Johnson JL.Emerging regulators of vascular smooth muscle cell function in the development and progression of fatherosclerosis[J].Cardiovasc Res，2014，103(4)：452-460.

[3] Higuchi S，Ohtsu H，Suzuki H，et al.Angiotensin Ⅱ signal transduction through the AT1 receptor： novel insights into mechanisms and pathophysiology[J].Clin Sci(Lond)，2007，112(8)：417-428.

[4] Joshua K，Hill BG.Autophagic regulation of smooth muscle cell biology[J].Redox Biology，2015，4：97-103.

[5] Choi AM，Ryter SW，Levine B.Autophagy in human health and disease[J].N Engl J Med，2013，368(7)：651-662.

[6] Gatica D，Chiong M，Lavandero S，et al.Molecular mechanisms of autophagy in the cardiovascular system[J].Circ Res，2015，116(3)：456-467.

[7] 陳克芳，李建軍，潘愛珍，等.山茱萸總苷干預急性缺氧乳鼠心肌細胞凋亡線粒體通路的研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2015，13(08)：970-972.

[8] Joshua K，Hill BG.Mitochondrialfission induced by platelet-derived growth factor regulates vascular smooth muscle cell bioenergetics and cell proliferation[J].Redox Biology，2013 ，1(1)：542-551.

[9] Grootaert MO，da Costa Martins PA，Bitsch N，et al.Defective autophagy in vascular smooth muscle cells accelerates senescence and promotes neointima formation and atherogenesis[J].Autophagy，2015，11(11): 2014-2032.

[10] Joshua K，Cummins TD，Singh M，et al.PDGF-mediated autophagy regulates vascular smooth muscle cell phenotype and resistance to oxidative stress[J].Biochem J，2013，451(3)：375-388.

[11] Michiels CF，Fransen P，De Munck DG，et al.Defective autophagy in vascular smooth muscle cells alters contractility and Ca2+homeostasis in mice[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2015，308(6)：H557-H567.

[12] Tang B，Dong X，Wei Z，et al.Enhanced autophagy by everolimus contributes to the antirestenotic mechanisms in vascular smooth muscle cells[J].J Vasc Res，2014，51(4)：259-268.

(本文編輯薛妮)

中山大學孫逸仙紀念醫院(廣州 510120)

李建軍，E-mail：ljj1965wuan@126.com

R543 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.02.010

1672-1349(2017)02-0161-05

2016-03-22)

引用信息：侯祥平，陳柳丹，林玉潔，等.自噬在血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞遷移和增殖的作用[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(2)：161-165.